丁亚茹 陈玉蓝 林正全 拓阳阳 李斌 李红丽 王岩

摘  要：为有效防治土传病害，利用16S rRNA和18S rRNA基因测序分析了成熟期健康与易感病烟田根际土壤微生物群落组成差异，并研究了微生物与理化性质，酶活性之间的相关性。结果表明，norank_p_Saccharibacteria、norank_o_Gaiellales、Nocardioides、norank_o_Sordariales和Pseudallescheria是造成健康与易感病烟田根际土壤微生物群落组成差异的关键物种。土壤有机质、全磷、全氮、有效磷、碱解氮、蛋白酶、脲酶、过氧化氢酶和磷酸酶在健康与易感病烟田中差异极显著。烟田根际微生物与土壤性质之间的相关性表现为，Nocardioides与有机质（r=0.943）和磷酸酶（r=0.941）极显著正相关，与过氧化氢酶（r=?0.880）和蛋白酶（r=?0.829）显著负相关，norank_o_Sordariales与有机质（r=0.829）、全磷（r=0.943）、碱解氮（r=0.943）和脲酶（r=0.943）极显著正相关，与过氧化氢酶（r=?0.941）极显著负相关。研究结果为通过调控微生物群落结构防治烟草土传病害提供了理论依据。

关键词：根际土壤;群落组成;理化性质;酶活性;相关性

Study on Microbial Community Composition in Rhizosphere Soil of Tobacco Fields with Different Disease Incidence Rates

DING Yaru¹， CHEN Yulan²， LIN Zhengquan³， TUO Yangyang⁴， LI Bin^4*， LI Hongli^1*， WANG Yan¹

（1.College of Chemical Engineering and Energy， Zhengzhou University， Zhengzhou 450001， China; 2. Liangshan Prefecture Company of Sichuan Tobacco Company， Xichang， Sichuan 615000， China; 3. Ningnan Branch of Liangshan Prefecture Company of Sichuan Tobacco Company， Ningnan， Sichuan 615400， China; 4. Sichuan Provincial Tobacco Company Liangshan Company Dechang Branch， Dechang， Sichuan 615500， China）

Abstract： To effectively prevent the occurrence of soil-borne diseases， 16S rRNA and 18S rRNA gene sequences were used to analyze the differences in microbial community composition between rhizosphere soils of healthy and susceptible tobacco fields during the mature period， and the correlations between physicochemical properties， enzyme activity and microorganisms were studied. The results showed thatnorank_p_Saccharibacteria，norank_o_Gaiellales，Nocardioides， norank_o_Sordariales and Pseudallescheriawere the key genus causing differences in microbial community composition between healthy and susceptible tobacco fields. There were significant differences in organic matter， total phosphorus， total nitrogen， available phosphorus， alkaline nitrogen， protease， urease， catalase and phosphatase in the soils of healthy and susceptible tobacco fields. And the correlations between rhizosphere microbial and soil properties in tobacco fields are the following：Nocardioideswas significantly positively correlated with organic matter （r=0.943）， phosphatase （r=0.941）， was significantly negatively correlated with catalase （r=?0.880） and protease （r=?0.829）.norank_o_Sordarialeswas significantly positively correlated with organic matter （r=0.829）， total phosphorus （r=0.943）， alkaline nitrogen （r=0.943）， urease （r=0.943）， and extremely significantly negative correlation with catalase （r=?0.941）. The results provide a theoretical basis for controlling soil-borne diseases of tobacco by regulating the structure of microbial communities.

Keywords： rhizosphere soil; community composition; physicochemical properties; enzyme activity; correlation

烟草作为四川省凉山州的支柱性产业，越来越受到重视。但近年来由于长期连作，烟田土传病害越发严重，特别是黑胫病、青枯病、根腐病和根结线虫，直接影响烟叶品质及农民收入^[1]。虽有大量关于烟田土传病害的研究，但以往关注点主要在种植方式、烤烟品种、有益菌筛选等方面^[2-4]，而病害的发生受多因素的影响，关键还是土壤。

土壤是微生物生存的大本营，健康土壤中微生物可增加养分利用率、产生生长激素和抗病因子，进而促进植物生长，提高植物抗病性^[5]。但微生物群落结构受土壤环境因素的影响较大^[6-7]，了解土壤微生物群落结构特征及其与环境之间的关系显得尤为重要。为此，本研究通过对比健康烟田（未发病或零星發病）与易感病烟田（以黑胫病为主的土传病害，前两年发病率分别为52%和50%）根际土壤微生物群落组成特征，分析其与环境因子之间的关系，探讨土壤微生物群落与土传病害的内在联系，为定向调控土壤微生物群落结构和提高土壤质量提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  烟田概况与取样

取样地点为四川凉山州德昌县，经度102°11'17''，纬度27°25'40''，海拔1560 m，烤烟品种为云烟87。2016—2017年发病率如表1所示，根据发病率，健康烟田和易感病烟田编号分别为H和S，每块烟田面积约220 m²，土质为砂土，2018年前茬为油菜，于2018年3月26日（移栽前），在每块烟田随机选5个点，取0～20 cm土样，基本理化性状如表2所示。于2018年7月26日取成熟期土样，并按5点取样法选取烟株，抖土法采集根际土壤，将土样混匀，装袋编号，每块烟田3个平行样。部分土壤装离心管，?20 ℃保存，送上海美吉生物医药科技有限公司进行微生物多样性基因测序，部分土壤风干研磨后过不同孔径筛，用于理化性状及酶活性的测定。

1.2  测定方法

1.2.1  土壤理化性质  土壤pH、有机质、全氮、全磷、全钾、速效钾、有效磷和碱解氮含量参照文献[8]的方法测定。

1.2.2  土壤酶活性  土壤蛋白酶活性的测定采用福林试剂比色法^[9];蔗糖酶活性测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法^[10];脲酶活性的测定方法为靛酚蓝比色法^[10];过氧化氢酶活性测定采用容量法^[9];磷酸酶活性采用对硝基苯磷酸二钠比色法测定^[11]。

1.2.3  微生物基因测序  土壤微生物基因测序采用第二代高通量测序技术，利用多样性基因测序对烟株土壤样本进行细菌（16S rRNA）^[12]和真菌（18S rRNA）^[13]序列检测。

1.3  数据处理

试验数据采用WPS 2019进行计算处理，利用SPSS 22软件进行方差分析，显著性检验采用独立样本T检验。基因测序利用上海美吉生物医药科技有限公司平台软件进行分析。

2  结  果

2.1  健康与易感病烟田根际土壤理化性质及酶活性

健康与易感病烟田根际土壤理化性质和酶活性如表3所示，从表3可看出，健康与易感病烟田根际土壤酶活性和理化性质存在差异，其中极显著性差异（p<0.01）有蛋白酶、脲酶、过氧化氢酶、磷酸酶活性，有机质、全磷、全氮、有效磷和碱解氮含量，且结果显示，除蛋白酶、过氧化氢酶活性及全钾含量以外，其余都是易感病烟田高于健康烟田。

2.2  根际土壤微生物在门水平上的群落组成分析

土壤微生物群落组成分析主要反映分类学水平上的群落结构及相对丰度，图1为健康与易感病烟田根际土壤细菌1（a）和真菌1（b）在门水平上的群落组成。由图1（a）可知，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）总丰度在健康烟田与易感烟田分别占细菌总量的72.65%、71.59%，而厚壁菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、糖化菌门（Saccharibacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）所占比例较低，其中健康烟田根际土壤中糖化菌门相对丰度比易感病烟田高62.75%，而厚壁菌门和芽单胞菌门在易感病烟田相对丰度分别比健康烟田高31.89%和46.23%。

由图1（b）可知，健康与易感病烟田根际土壤真菌在门水平上有6种优势菌种，相对丰度最高的子囊菌门（Ascomycota），在健康与易感病烟田根际土壤相对丰度分别为77.03%和82.03%，健康烟田中担子菌门（Basidiomycota）、norank_k_Fungi、unclassified_k_Fungi和壶菌门（Chytridiomycota）相对丰度依次比易感病烟田高20.50%、65.41%、29.41%、和8.29%，易感病烟田的纤毛门（Ciliophora）比健康烟田高8.04%。

2.3  根际土壤微生物在属水平上的群落组成分析

属水平上，健康与易感病烟田根际土壤微生物群落组成如图2所示，由图2（a）可知，健康烟田中细菌相对丰度超过2%的有鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、norank_p_Saccharibacteria、芽孢杆菌属（Bacillus）、unclassified_f_Micrococcacea、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）和寡养单胞菌属（Stenotrophomonas），其中norank_p_ Saccharibacteria、unclassified_f_Micrococcacea和Stenotrophomonas在易感病烟田根际土壤相对含量分别比健康烟田低38.56%、61.28%和97.01%，而Sphingomonas和Bacillus分别比健康烟田高27.31%和42.91%。值得注意的是，norank_o_Gaiellales和类诺卡氏菌属（Nocardioides）在健康烟田仅为1.94%和0.64%，而在易感病烟田中其含量为3.56%和2.42%。

2.3.1  根际土壤微生物在属水平上组间差异性检验  属水平上，根腐病与青枯病的病原菌在健康和易感病烟田的相对丰度：Fusarium（5.23%，6.59%）和劳尔氏属（Ralstonia）（0.05%，0.07%），以上两种菌在健康烟田与易感病烟田中并不存在显著差异。同时发现，移栽前，健康烟田与易感病烟田青枯病病原菌数量几乎相同，根腐病病原菌属则表现出极显著性差异（表4）。

为找出细菌和真菌在健康与易感病土壤之间的差异性物种，将细菌和真菌在属水平上的相对丰度数据运用Student's T检验进行差异分析，获取显著性差异物种。按物种丰度降序，列出了在健康与易感病土壤之间存在显著差异的前5种菌属（图3）。前5种具有显著差异的细菌分别是norank_p_Saccharibacteria、Bacillus、norank_o_Gaiellales、Nocardioides和norank_o_Acidimicrobiales（圖3a）。其中，健康烟田中norank_p_Saccharibacteria相对丰度显著高于易感病烟田，而Nocardioides相对丰度在健康与易感病烟田差异明显，norank_o_Gaiellales显著性差异最大（p≤0.001），其可能是造成健康与易感病烟田群落组成差异的关键物种。真菌在属水平上，具有显著差异的前5种菌属分别是norank_o_Sordariales、norank_o_Tremellales、norank_p_Ascomycota、假霉样真菌属（Pseudallescheria）和norank_o_Chaetothyriales（图3b）。其中，norank_o_Sordariales在易感病烟田占据显著优势，Pseudallescheria相对丰度虽不高，但达到了极显著差异。

2.3.2  根际土壤微生物差异物种与理化性质、酶活性之间的相关性  为探讨影响健康与易感病烟田根际土壤微生物群落组成差异的因素，将显著差异物种与表现出极显著差异的土壤环境因子进行Spearman相关性分析（表5和6）。发现，norank_p_Saccharibacteria与全氮和有效磷极显著负相关，与蛋白酶显著正相关。norank_o_Gaiellales与有机质和磷酸酶极显著正相关，与过氧化氢酶极显著负相关。Nocardioides与有机质和磷酸酶极显著正相关，与过氧化氢酶和蛋白酶显著负相关。norank_o_Sordariales与有机质、全磷、碱解氮和脲酶极显著正相关，与过氧化氢酶极显著负相关。Pseudallescheria与磷酸酶显著正相关，与蛋白酶显著负相关，表明土壤环境与土壤微生物群落结构之间存在一定关系。

3  讨  论

本研究结果表明，健康与易感病烟田根际土壤细菌在门水平优势菌组成基本相似。变形菌门、放线菌门和绿弯菌门为优势菌群，这与前人测定的烟田土壤中优势菌一致^[14-15]。放线菌，大多为腐生细菌，能够将动植物残骸腐烂，但少数寄生性放线菌则能引起某些动植物病害^[16-17]，本试验结果显示，与健康烟田相比，放线菌门中的norank_o_Gaiellales和Nocardioides在易感病烟田占显著优势，且都与有机质有极强的正相关性，李盼盼等^[18]研究发现，有机质含量过高，可能会影响烟株的生长，有机质含量越高，可能越有利于潜在病原菌的生长，导致有益菌相对丰度下降，进而影响植株的正常生长，例如，糖化细菌门中norank_p_Saccharibacteria相对丰度在易感病烟田显著下降，糖化细菌可利用微生物处理的植物源碳为自身提供能量，通过与有害微生物竞争改善土壤质量^[19-21]。真菌中子囊菌门在易感病烟田中占据明显优势，其中，易感病烟田中norank_o_Sordariales相对丰度较健康烟田高54.62%，与全磷和碱解氮有极强的相关性，该菌属于子囊菌门粪壳菌纲（Sordariomycetes），粪壳菌纲中含有较多植物病原菌，能够侵染植物根系，引发植物病害^[22]，从侧面反映出合理控制土壤养分对于减少潜在病原菌的富集至关重要。陈乾锦等^[14]在研究青枯病时发现，Pseudallescheria在发病土壤中丰度较高，且是健康土壤的2倍，而本研究结果显示，Pseudallescheria虽在健康与易感病烟田表现出极显著性差异，但相对丰度较低，考虑到易感病烟田未出现发病情况，推测Pseudallescheria的丰度与青枯病的发生存在一定的联系。2018年易感病烟田未发病，但易感病烟田青枯病病原菌属Ralstonia及根腐病病原菌属Fusarium含量均高于健康烟田（虽未达到显著水平）。总之，易感病烟田中含有较多的潜在病原菌，虽未产生病害，但并不能说明其已向健康烟田转化，可能与气候有一定的关系，需进一步分析。

同时，在健康烟田根际土壤中存在较多的有益菌，比如unclassified_f_Micrococcacea和Bradyrhizobium，这两种菌虽未达到显著水平，但其相对丰度较易感病烟田高。相关研究证实，unclassified_f_Micrococcacea，放线菌门下的微球菌科，感染青枯病的土壤中unclassified_f_

Micrococcacea相对丰度显著低于健康土壤^[14];Bradyrhizobium，一种固氮菌，在患青枯病烟株根际土壤中占据显著优势^[23]，与本研究结论相悖，但说明这两种菌同样与青枯病存在一定的关系，具体关系有待进一步探讨。易感病烟田根际土壤中也含有有益菌，比如厚壁菌门下的Bacillus。众多文献中提到Bacillus对黑胫病及根腐病有较好的防治作用^[15，24-26]。同时，它还是高效的解磷微生物，为植物提供磷素营养^[27-28]，从侧面证实了易感病烟田根际土壤中有效磷和磷酸酶活性较高的原因。

众所周知，土传病害的发生需满足高温高湿的条件，比如，黑胫病最适宜温度为24～25 ℃，當相对湿度达到80%以上且保持3～5 d，才会出现发病高峰期;青枯病，30～35 ℃为最适宜温度，相对湿度达90%以上且保持7～10 d，烟株才会出现典型症状^[29]。而2018年四川凉山州德昌县并未出现高热高湿气候，有益菌占领主要生态位，抑制了病原菌繁殖，潜在病原菌没有适宜的生长环境，易感病烟田土壤微生物达到了动态平衡，减轻了潜在病原菌对烟株的影响，最终使易感病烟田几乎没有发病。今后应持续跟进调查，进一步研究烟田发病程度与土壤微生物菌群的关系。

4  结  论

健康与易感病烟田根际土壤微生物群落组成存在差异，易感病烟田中存在较多潜在病原菌。土壤性质会影响微生物的群落结构，可通过调控措施改善土壤性质及微生物群落结构，减少病原菌定殖，有效防控烟田土传病害，实现易感病烟田向健康烟田转化的目的。

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