温俊婷， 李子杰， 高晓冬*

（1. 江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122；2. 江南大学 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

稀有糖（rare sugar）指自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物[1]。 目前已发现34 种稀有糖及糖醇[2]，包括D-阿洛酮糖、D-塔格糖、D-阿洛糖等。 稀有糖具有独特的生物活性，可作为添加剂改善食品的理化性质[3]，发挥多种生理功能[4-5]，因此在食品、保健、医药等领域引起了广泛关注。

D-阿洛酮糖（D-psicose）属于稀有糖中的一种，其甜度为蔗糖的70%， 但能量仅为蔗糖的0.3%，具有低热量的特性，可作为蔗糖的食用性替代物[6-7]。 随着稀有糖研究的不断推进，D-阿洛酮糖受到了广泛的关注，其在医疗、保健方面具有显著功效，如降血糖[8]、降血脂[9]，因而非常适用于糖尿病患者的食用[10]。另外，D-阿洛酮糖可以作为肝脂类酶[11]和肠道α-糖苷酶的抑制剂，减少脂肪堆积[12]，具有减肥功效。

D-阿洛酮糖在自然界中含量极少，主要存在于小麦、鼠刺植物以及甜菜糖蜜中[13-14]。 目前应用较广泛的合成方法为化学合成法和生物合成法。 相较于化学合成法，生物合成法的优势更为突出，例如反应条件温和、副产物少、利于目的产物的纯化，因此更适合工业化生产[15]。

目前最常见的酶法合成方法是利用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（D-psicose-3-epimerase，DPE）催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的转化[16-17]。 但由于DPE 催化的异构化反应是一个可逆的过程， 所以D-阿洛酮糖的产率较低[18]。 因此，如何提高异构化反应的转化率是生产D-阿洛酮糖所面临的重大挑战。

L-鼠李树胶糖激酶 （L-rhamnulose kinase，RhaB）是己糖激酶-hsp70-超蛋白家族成员[19]，其N端结构域是ATP 的结合位点， 可以控制ATP 的结合过程。 RhaB 是一种底物特异性激酶[20]，同时也是大肠杆菌体内代谢L-鼠李糖所涉及的关键酶之一[21]。其催化的底物为C3-R 构型的稀有糖，如D-阿洛酮糖。 它的催化机制为： 将D-阿洛酮糖磷酸化生成D-阿洛酮糖-1-磷酸，同时消耗一分子ATP，生成对应的ADP。由于RhaB 催化的反应为不可逆过程，因此将异构酶DPE 与RhaB 串联，可以破坏异构化反应的平衡，从而提高D-阿洛酮糖的产率，有利于工业化生产。

多聚磷酸盐激酶（polyphosphate kinase，PPK）分为2 种：多聚磷酸盐激酶1（PPK1）和多聚磷酸盐激酶2 （PPK2）， 其中PPK1 主要负责多聚磷酸盐（polyphosphate，polyP）的合成以及ATP 的代谢（合成）[22]，参与的酶促反应为：

PPK2 主要负责GTP 的代谢， 大肠杆菌中只有PPK1，不存在PPK2[23]。 由于PPK1 催化的反应为可逆过程，当ATP / ADP 值偏低时，PPK1 可催化ADP转化为ATP[24]。因此，本文中主要利用大肠杆菌来源的PPK1 参与的ATP 再生过程，以减少反应中ATP的用量和ADP 的积累， 从而降低合成D-阿洛酮糖的成本。

本研究中将重组蛋白RhaB 在大肠杆菌中大量表达，以D-阿洛酮糖为底物，研究RhaB 的酶学性质，并对纯酶RhaB 的反应条件进行优化。 同时，将梭状芽孢杆菌（Clostridium cellulolyticumH10）来源的DPE 和大肠杆菌来源的RhaB 酶偶联，以D-果糖为底物，优化偶联体系的反应条件，计算反应的转化率。 最后，将DPE、RhaB 和PPK（E. coli）三酶偶联，降低ATP 的用量，合成D-阿洛酮糖。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 质粒和菌株 pET-28a 质粒： 购于Novagen公司；pET28a-rhaB、pET28a-ppk： 作者所在实验室构建；大肠杆菌MG1655 和Rosetta （DE3）：作者所在实验室保存；pET28a-dpe： 作者所在实验室前期构建的质粒。

1.1.2 酶、 试剂及耗材 限制性内切酶和DNA 连接酶：购于TaKaRa 生物公司；腺苷-5′-三磷酸二钠盐（ATP）和多聚磷酸盐（polyphosphate，polyP）：购于上海生工生物公司；卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、酸性磷酸酶（acid phosphatase from sweet potato，AP）： 购于Sigma-Aldrich 公司；Ni2+亲和层析柱：购于GE 公司；D-果糖：购于阿拉丁有限公司；D-阿洛酮糖：购于TCI（上海）化成工业发展有限公司；C18色谱柱（250 mm×4.6 mm）和Sugar-PakTM色谱分析柱（300 mm×6.5 mm）：购于Waters 公司。

1.1.3 培养基及其他溶液配制 TB 培养基： 酵母抽提物（24 g/L），胰蛋白胨（12 g/L），K2HPO4·3H2O（16.4 g/L），KH2PO4（2.31 g/L），甘油体积分数0.4%。LB 固体培养基：胰蛋白胨（10 g/L），酵母抽提物（5 g/L），NaCl （10 g/L），琼脂粉（20 g/L）；湿热灭菌121 ℃，20 min。

蛋白质纯化缓冲液：1） 裂解、 平衡缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl（ pH 8.0），150 mmol/L NaCl；洗涤缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0），150 mmol/L NaCl，60 mmol/L imidazole；2）洗脱缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0），150 mmol/L NaCl，500 mmol/L imidazole；3） 脱盐缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0），50 mmol/L NaCl。

1.2 仪器与设备

PCR 分析仪：Eppendorf 公司产品；Bio-Rad Power/PAC300 电泳仪：美国伯乐公司产品；高效液相色谱仪HPLC：日本日立公司产品；超声波细胞粉碎机：南京新辰生物科技有限公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 重组质粒的构建 采用PrimeSTAR 聚合酶进行PCR 时， 以大肠杆菌BL21 菌液为模板，以rhaB-F：5′-GCGCGGATCCATGACCTTTCGCAATTG TGTC-3′（BamH I）为上游引物，以rhaB-R：5′- GCG CAAGCTTTCATGCGCAAAGCTCCTTTGT -3′ （Hind III）为下游引物来扩增rhaB基因。 采用BamH I 和Hind III 2 种限制性内切酶分别对pET-28a 和rhaB基因进行双酶切处理，37 ℃静置3 h。 反应结束后，对酶切产物进行胶回收，并用DNA 连接酶ligationmix 将基因片段和质粒片段进行连接，16 ℃静置2 h。将连接产物转入大肠杆菌感受态，冰浴25 min，42 ℃热激40 s，冰上放置3 min。将转化产物涂布于带有卡那霉素抗性的平板进行筛选，挑取转化子进行菌落PCR 鉴定，并进行质粒提取、酶切验证和基因测序， 从而得到正确编码的表达载体pET28arhaB。 pET28a-dpe为作者所在实验室前期构建的质粒。 pET28a-ppk的构建方法同上。

1.3.2 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 将重组质粒pET28a-rhaB转入大肠杆菌Rosetta（DE3）中，转化步骤同上，涂布到LB-Kan 平板上，37 ℃过夜培养，挑取正确的转化子在5 mL LB-Kan 培养基中37 ℃过夜培养后，取500 μL 培养基，离心收集菌体作为诱导前样品， 另取2 mL 转接入200 mL TB-Kan 培 养 基 中，37 ℃摇 床 培 养3 ～4 h，待OD600为0.6～0.8 时，加入IPTG 诱导（终浓度0.1 mmol/L），16 ℃诱导20 h，取500 μL 培养基，离心收集菌体作为诱导后样品， 另取5 mL 菌体超声破碎离心， 分别取上清液和沉淀用于SDS-PAGE 检测。剩余培养基收集菌体，-20 ℃保存待用。

1.3.3 重组蛋白的分离纯化及脱盐 菌体收集后，平衡缓冲液清洗2 遍，用10 mL 平衡缓冲液充分悬浮菌体，超声破碎，4 ℃下超声5 s 间歇5 s，超声时间共为30 min。 结束后12 000g离心30 min，收集上清液，用于蛋白质纯化。 破碎上清液中存在大量杂蛋白质，采用Ni2+亲和层析柱对其进行纯化，可以得到高浓度、纯净的目的蛋白。 蛋白质纯化步骤如下：取30 mL 去离子水清洗Ni2+亲和层析柱，约6 个柱体积；10 mL 0.1 mol/L NiSO4再生柱子，去离子水洗掉柱子中多余Ni2+；20 mL 平衡缓冲液平衡Ni2+亲和层析柱，约4 个柱体积；缓慢上样，使上清液中蛋白质与Ni2+柱充分结合； 取20 mL 平衡缓冲液再次平衡Ni2+亲和层析柱， 洗掉未结合的蛋白质；20 mL洗涤缓冲液平衡Ni2+亲和层析柱， 利用低浓度咪唑洗掉与Ni2+柱结合较弱的杂蛋白质；20 mL 洗脱缓冲液平衡Ni2+亲和层析柱， 利用高浓度咪唑洗脱并收集与Ni2+柱结合较强的目的蛋白；20 mL 0.1 mol/L EDTA 洗掉Ni2+； 最后20 mL 0.1mol/L NaOH 保存柱子。

由于最后收集到的洗脱液里含有高浓度的咪唑和NaCl，为避免其影响后续反应，需要进行脱盐处理。 纯化后的蛋白质经由超滤管进行浓缩，4 ℃下，4 000g离心30 min，并换用脱盐缓冲液以降低蛋白质中的盐浓度。 最后，利用BCA 蛋白质浓度检测试剂盒精确检测目的蛋白浓度， 分装后加入甘油，-80 ℃长期保存。 DPE、PPK 的表达纯化步骤与RhaB 一致。

1.3.4 重组蛋白RhaB 活性测定方法 检测RhaB的活性反应条件 （250 μL 反应体系） 如下： 在50 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）缓冲液中，加入D-阿洛酮糖5 g/L，5 mmol/L Mg2+，30 mmol/L ATP，0.2 g/L RhaB，在35 ℃反应30 min 后，用高浓度NaOH 调pH， 终止反应。 15 000g离心10 min， 上清液过0.22 μm 的水膜除去杂质， 通过高效液相色谱（HPLC）检测是否有产物的产生。 利用色谱柱C18来测定反应液中ATP 和ADP 的含量。 HPLC 工作条件：0.1 mol/L KH2PO4（pH 6.25）作为流动相，流速1 mL/min，柱温箱温度25 ℃，用紫外检测器进行检测（λ=254 nm）。

1.3.5 DPE 和RhaB 偶联体系的活性测定方法 检测DPE 和RhaB 偶联体系的活性反应条件（250 μL反应体系）如下：在50 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）缓冲液中， 加入D-果糖5 g/L，Mg2+5 mmol/L，ATP 30 mmol/L，DPE 0.2 g/L，RhaB 0.4 g/L，在35 ℃反应30 min 后，100 ℃灭活10 min，15 000g离心取上清液， 将pH 值调为5.0 左右， 外加酸性磷酸酶AP（0.8 μL）处理，30 ℃静置过夜。 反应结束后，将pH值调回7.0 左右，100 ℃加热10 min， 终止反应。15 000g离心，上清液过0.22 μm 的水膜除去杂质，利用Sugar-PakTM色谱分析柱来检测产物D-阿洛酮糖的生成量。 HPLC 工作条件： 流动相为500 mg/L EDTA 钙盐，其流速为0.5 mL/min，柱温80 ℃，RI 示差检测器。

1.3.6 DPE、RhaB 和PPK 偶联体系的活性测定方法 检测DPE、RhaB 和PPK 偶联体系的活性反应条件（250 μL 反应体系）如下：在50 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）缓冲液中，加入D-果糖5 g/L，Mg2+5 mmol/L，ATP 6 mmol/L，polyphosphate 6 mmol/L，DPE 0.2 g/L，RhaB 0.4 g/L，PPK 0.4 g/L， 在35 ℃反应1 h 后，后续步骤参照1.3.5。

1.3.7 重组蛋白RhaB 反应条件的优化 温度和pH 对RhaB 活性的影响均以1.3.4 中所提到的反应体系为基础，反应时间均为30 min。 相对酶活定义为各组样品转化率相对于最高转化率所占的百分比。为了测定温度对RhaB 活性的影响，以50 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）作为缓冲液，采用不同温度（10～70 ℃） 测定RhaB 的酶活。 为了测定不同pH 对RhaB 活性的影响，采用3 种不同缓冲液测定酶活，pH 5.0～7.0 为磷酸缓冲液，pH 7.0～9.0 为Tris-HCl缓冲液，pH 9.0～11.0 为Glycine-NaOH 缓冲液。

1.3.8 DPE 和RhaB 偶联体系的条件优化 为了测定温度对偶联体系活性的影响， 反应体系参照1.3.5。采用不同温度（10～70 ℃）测定酶活，反应时间为30 min。 为了测定不同pH 对偶联体系活性的影响，采用3 种不同缓冲液测定酶活，pH 5.0～7.0 为磷酸缓冲液，pH 7.0～9.0 为Tris-HCl 缓冲液，pH 9.0～11.0 为Glycine-NaOH 缓冲液。 为了测定金属离子对偶联体系活性的影响，选取Mg2+、Ca2+以及Mn2+等8 种离子测定酶活。 为了测定DPE 和RhaB 酶比例对偶联体系活性的影响， 采用不同的酶质量比（1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1）测定酶活，其他条件不变。

2 结果与讨论

2.1 RhaB 和DPE 在大肠杆菌中的表达

根据大肠杆菌来源的rhaB基因的理论碱基序列长度，软件预测出其蛋白质相对分子质量为5.3×104。SDS-PAGE（见图1（a））显示，经IPTG 诱导20 h后， 样品在5.0×104～7.0×104之间有清晰的目的条带，相对分子质量在5.3×104左右，与预测大小基本一致。 同时，RhaB 蛋白质大量表达在上清液中，经Ni2+亲和层析柱纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。同理，DPE 的相对分子质量大小为3.4×104，与理论值吻合（见图1（b））。

图1 SDS-PAGE 检测RhaB 和DPE 的表达Fig. 1 SDS-PAGE analysis of RhaB and DPE expression

2.2 RhaB 的酶活性分析

RhaB 磷酸化D-阿洛酮糖生成D-阿洛酮糖-1-磷酸，后者是一种比较昂贵的磷酸化单糖，目前在市场上难以获得，因此本研究中通过检测另一副产物ADP 的生成来验证RhaB 酶活性。由图2 可知，反应初始，体系中仅含有ATP；反应30 min 后，ATP 的峰值降低，ADP 的峰生成， 加入脱磷酸酶AP 后，ATP 和ADP 的峰均消失。 由此说明RhaB 的确催化D-阿洛酮糖生成D-阿洛酮糖-1-磷酸， 并将ATP转化成ADP。

图2 HPLC 检测RhaB 的活性Fig. 2 Activity of RhaB detected by HPLC

2.3 温度、pH 对RhaB 活性的影响

研究温度、pH 对RhaB 活性的影响， 如图3（a）所示，当温度为35 ℃时，RhaB 活性最高，且耐受温度范围较广；在10 ℃时，活性仍可达到60%以上，在60 ℃的高温下仍保有80%左右的酶活；但当温度高于70 ℃时，酶活逐渐丧失。 根据报道，来自海栖热袍菌MSB8（Thermotoga maritimaMSB8）的RhaB最适反应pH 值为8.0[25]。 由图3（b）可知，来自大肠杆菌的RhaB 最适pH 值为8.0，且该酶在弱酸或弱碱下，仍保有50%以上的酶活。

图3 温度、pH 对RhaB 活性的影响Fig. 3 Effect of temperature and pH on RhaB activity

图4 温度、pH 对DPE 和RhaB 偶联体系活性的影响Fig. 4 Effect of temperature and pH on the activity of DPE and RhaB

2.4 温度、pH 对DPE 和RhaB 偶联体系活性的影响

由2.3 可知，RhaB 酶的最适温度为35 ℃，而文献报道DPE 酶的最适温度为55 ℃，二者相差较大，因此需要确定偶联体系的最适反应温度。如图4（a）所示，偶联体系在35 ℃时拥有最高酶活，温度继续升高后，酶活逐渐下降。 另外，RhaB 和DPE 对外界温度的变化均有较强的适应性， 在10～70 ℃范围内，酶活可以保持在51%以上。 由图4（b）可知，当pH 值为8.5 时，整个体系的酶活性最高；当pH 偏酸性时，酶活性迅速降低，仅有10%；当外界环境偏碱性时，酶活趋势稍有下降，但仍保持在50%以上。 因此，该反应更适合于在碱性环境下进行。

2.5 金属离子、酶质量比对DPE 和RhaB 偶联体系活性的影响

由文献报道可知，DPE 是Co2+依赖型酶，而RhaB 是一种激酶， 因此需要研究金属离子对偶联体系酶活的影响。 如图5（a）所示，Co2+存在条件下，反应的转化率最高，其次是Mg2+和Mn2+；相比于不加金属离子，多数离子显著提高了酶活，但Cu2+却使酶活降低。考虑到Co2+属于工业重金属离子，本实验选择Mg2+加入反应体系中。 如图5（b）所示，当DPE和RhaB 的质量比为1∶2 时，该体系的转化率最高，可达70%；随着DPE 所占比例的提高，反应的转化率逐渐降低。 因此，RhaB 的酶质量应为DPE 的2 倍。

图5 各种金属离子、酶质量比对DPE 和RhaB 偶联体系活性的影响Fig. 5 Effect of various metal ions and enzyme ratios on the activity of DPE and RhaB

2.6 DPE 和RhaB 偶联体系的活性

本实验在上述最适条件下，以D-果糖为底物，在DPE 和RhaB 共同催化下合成D-阿洛酮糖-1-磷酸，外加酸性磷酸酶AP 处理后，可得到产物D-阿洛酮糖， 利用Sugar-PakTM色谱分析柱检测D-阿洛酮糖的生成，如图6 所示，D-果糖和D-阿洛酮糖的出峰时间分别为11.6 min 和16.1 min。 根据HPLC 结果计算可得： 偶联体系的反应转化率约为70%，该体系显著提高了D-阿洛酮糖的得率。

2.7 PPK 在大肠杆菌中的表达

根据大肠杆菌来源的ppk基因的理论碱基序列长度， 软件预测出其蛋白质相对分子质量为8.0×104。 SDS-PAGE（见图7）显示，相对分子质量在8.0×104左右，与预测大小基本一致。同时，PPK 蛋白质大量表达在上清液中，纯化后所得目的蛋白质较少，再对蛋白质进行浓缩除盐，结果发现PPK 的蛋白质质量明显增多，但同时含有一定量的杂蛋白质。

图7 SDS-PAGE 检测PPK 的表达Fig. 7 SDS-PAGE analysis of PPK expression

2.8 DPE、RhaB 和PPK 偶联体系的活性

本实验在上述反应条件的基础上， 以D-果糖为底物， 同时将ATP 用量降低至原来的1/5，在DPE、RhaB 和PPK 共同催化下合成D-阿洛酮糖-1-磷酸，外加酸性磷酸酶AP 处理后，可得到产物D-阿洛酮糖， 利用Sugar-PakTM色谱分析柱检测D-阿洛酮糖的生成，如图8 所示，其中，图8（a）对照组为DPE 和RhaB 双酶混合， 图8 （b） 实验组为DPE、RhaB 和PPK 三酶混合。 根据HPLC 结果计算可得，在降低ATP 用量的条件下，双酶体系的转化率仅有27%，而三酶偶联体系的反应转化率可达到50%，因此，该体系显著提高了D-阿洛酮糖的得率。

图8 HPLC 分析DPE、RhaB 和PPK 偶联体系的活性Fig. 8 Activity of DPE，RhaB and PPK detected by HPLC

3 结 语

D-阿洛酮糖是一种功能性稀有糖，具有多种生理活性， 市场价格较高。 其合成方法主要为利用DPE 催化D-果糖直接转化为D-阿洛酮糖，但此反应为可逆过程，转化率较低。 本研究将DPE 催化的异构化反应与RhaB 参与的磷酸化反应串联， 借助后者的不可逆过程打破前者存在的可逆平衡，促进D-阿洛酮糖的合成，最终偶联体系的转化率可达到70%。在上述研究的基础上，构建DPE、RhaB 和PPK偶联体系，使得ATP 得以循环利用，同时减少体系中ADP 的积累。 结果表明，ATP 的用量降低至原来的1/5，同时最终产物得率为50%。 相比于双酶偶联体系，引入PPK 酶后，ATP 用量明显减少，反应转化率有所降低，原因可能是由于PPK 酶的纯度影响了产物的合成。 因此，在后期研究中，可考虑换用其他方法对PPK 进行纯化，以提高其纯度。综上所述，此法显著提高了D-阿洛酮糖的产率， 适用于稀有糖的大规模合成。 同时，建立的DPE、RhaB 和PPK 三酶偶联体系可应用于全细胞体系中，从而简化整个生产流程，具有实际应用意义。