吴家葳， 张文静， 迟乃玉， 王晓辉

（大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连116622）

卡拉胶（Carrageenan），又被称为石花菜胶、鹿角菜胶、角叉菜胶等，是一种亲水性较高的大分子多糖，它由半乳糖硫酸酯钾、钠、镁和钙以及3，6-脱水-D-半乳糖并聚物组成[1]。目前卡拉胶被大量应用于食品行业，如葡萄酒[2]、饮料[3]、果冻[4]、酸奶[5]等，其主要起杂质凝聚、增稠和凝固的作用。 卡拉胶可被降解为有较高活性的卡拉胶寡糖，成为卡拉胶寡糖后， 分子链上的活性基团可以更大程度的暴露，因此相对于大分子聚合物的卡拉胶而言，有着更高的活性[6]，且卡拉胶寡糖结构多样，物化性质复杂，并且有着抗氧化[7]、免疫调节[8]和抗肿瘤[9]的性质，因此其被广泛应用于食品、医药、化妆品等行业[10-11]。 卡拉胶寡糖可通过物理降解[12]、化学降解[13]和酶降解[14]得到。 化学降解法和物理降解法反应剧烈，且降解产物单一性差，反应条件不易控制，排放废物污染环境，因此应用方面受到了诸多的限制。 相比之下由于酶具有专一性强、稳定性强、反应温和等特点，并且微生物酶的活性相对较高，利用微生物产酶来降解卡拉胶得到卡拉胶寡糖能够节约能源，有着更大的经济效益[15]。 越来越多的卡拉胶裂解酶对丰富卡拉胶寡糖的种类有着重要作用。

卡拉胶酶属于水解酶类，可特异性地将卡拉胶分子的β-1，4 糖苷键切断，在酶的作用下大分子卡拉胶糖苷键断裂产生卡拉胶寡糖。 卡拉胶酶种类繁多， 其中κ-卡拉胶酶可专一性的使κ-卡拉胶结构单元中连接4-硫酸基-半乳糖和3，6-内醚-D-半乳糖的β-1，4 糖苷键断裂[16-17]。 目前研究表明已从假单胞菌[18]、链霉菌[19]、弧菌[20]等属的细菌中发现了多种κ-卡拉胶酶，且大部分酶已经在大肠杆菌[21-22]和毕赤酵母[23]中实现了重组表达，但卡拉胶酶依旧是制约卡拉胶寡糖构效关系的重要因素，也是卡拉胶寡糖研究乃至进一步应用开发的主要瓶颈因素[24-25]。当前市场酶解制备寡糖已经逐渐开始替代酸解法，因此其研究具有深远的理论意义和应用价值。 本研究中从辽宁省大连市海底泥中筛选得到一株高产卡拉胶裂解酶菌株， 经16S rDNA 测序鉴定为红球菌属。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 样品 采自13 个辽宁省大连市不同坐标位置的海泥。

1.1.2 药品与仪器 无机盐母液：MgSO4·7H2O 5.0 g，FePO4·4H2O 0.1 g，K2HPO4·12H2O 10.0 g，CaCl21.0 g，单蒸水1 000 mL。

富集培养基：κ-卡拉胶2.0 g，NaNO320.0 g，无机盐母液100 mL，海水900 mL；pH 7.5。

κ-卡拉胶筛选培养基：κ-卡拉胶12.0 g，NaNO320.0 g，NaCl 15.0 g， 琼脂15.0 g， 无机盐母液100 mL，海水900 mL；pH 7.5。

固体种子培养基：葡萄糖40 g，酵母膏20 g，蛋白胨20 g，NaCl 20 g，琼脂粉20.0 g，自来水1 000 mL；pH 7.0。

液体种子培养基：葡萄糖40 g，酵母膏20 g，蛋白胨20 g，NaCl 20 g，陈海水1 000 mL；pH 7.0。

发酵产酶培养基：κ-卡拉胶2 g，FeSO4·7H2O 0.02 g，蛋白胨3 g，陈海水1 000 mL；pH 值自然。

DNS 溶液（250 mL） ：1.625 g DNS 溶于少量蒸馏水中，溶解后移入250 mL 容量瓶中，加入2 mol/L NaOH 65 mL，再加入11.25 g 甘油，摇匀，待其冷却后定容至250 mL。

BPC-150F 型培养箱： 上海茸研仪器有限公司产品；DK-600S 型电热恒温水浴锅： 上海精宏实验设备有限公司产品；ZWY-2102C 型恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司产品；全波长酶标仪：北京昊诺斯科技有限公司产品；显微镜：尼康仪器（上海）有限公司产品；自动微生物鉴定分析系统：Biolog 公司产品；FP-1100-C 型Bioscreen C分析仪：Oy Growth Curves Ab Ltd 生产。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的富集与筛选 称取混合后的海泥10 g，放入盛有90 mL 富集培养基和玻璃珠的三角瓶中，25 ℃、160 r/min 过夜振荡培养，使样品充分分散。再吸取10 mL 富集培养液于盛有90 mL 无菌水并有小玻璃珠的250 mL 三角瓶中， 振荡15 min 使其摇匀。 梯度稀释后每个梯度取100 μL 涂布于κ-卡拉胶筛选培养基平板上，30 ℃倒置培养2～3 d，挑取生长良好、在平板上产生透明圈或凹坑的形态不一的菌落进行多次划线纯化，得到单菌落。

将分离得到的菌株挑取一环， 接种于5 mL 发酵培养基中，25 ℃、200 r/min 条件下培养36 h 后，将其以1%的接种体积分数接于100 mL 发酵培养基，25 ℃、160 r/min 条件下培养（3 组平行）。 连续每2 h 取发酵液离心（10 000 r/min、4 ℃、10 min）去除沉淀细胞，取上清液制成粗酶液，测定卡拉胶降解酶活力。

1.2.2 酶活力的测定 酶活力测定采用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法，以质量浓度为0.5 g/dL 的κ-卡拉胶（用50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4、pH 7.0 的缓冲液溶解）作为底物。

取50 μL 处理后的粗酶液（对照组1 的酶液以沸水浴5 min 后的50 μL 酶液代替）， 添加550 μL质量浓度为0.5 g/dL 的κ-卡拉胶溶液，35 ℃水浴20 min，沸水浴5 min 后加入0.9 mL DNS 溶液并沸水浴5 min，冷却至室温后加蒸馏水至5 mL，混匀，于520 nm 下测定吸光度值，以灭活酶液为对照组。利用实验组和对照组吸光度的差值计算还原糖的产生量。

1 个酶活力单位（U）定义为：在上述条件下，每分钟产生1 μg 还原糖的酶的剂量。

1.2.3 菌株的鉴定 对酶活力高的菌株进行形态学鉴定（菌落形态观察和革兰氏染色）、生理生化鉴定（Biolog 自动微生物鉴定分析系统）和分子生物学鉴定（菌株的16S rDNA 序列测定由大连宝生物公司扩增、测序），并与NCBI 核酸数据库进行比对，利用MEGA5 进行系统进化树的构建。

1.2.4 菌株生长曲线及产酶活性曲线的测定 挑取一环菌株于液体种子培养基中，160 r/min、25 ℃培养至OD600=0.5 后，以1%的接种体积分数接种于液体种子培养基中， 使用FP-1100-C 型Bioscreen C 分析仪（每孔300 μL，25 ℃震荡培养，每2 h 检测一次OD600，连续检测3 d）检测菌株生长情况，绘制菌株生长曲线。

挑取一环菌株接种于5 mL 的发酵培养基中，再以1%的接种体积分数接种100 mL 于发酵培养基中，25 ℃、160 r/min 条件下培养，每2 h 取样测其酶活， 连续检测3 d， 并设酶活最高时相对酶活为100%，绘制菌株产酶活性曲线。

2 结果与分析

2.1 产酶菌株的筛选

采用以κ-卡拉胶为唯一碳源的平板从海泥中分离出产卡拉胶酶的菌株，由于卡拉胶酶会使卡拉胶降解为还原糖，故会在平板上产生凹坑或水解透明圈。 接着再将初筛得到的菌株接入发酵培养基中，利用DNS 法检测是否产生还原糖，再次确定其是否有卡拉胶酶活力，并筛选出酶活力最强的菌株进行下一步试验。

通过初筛， 从13 个海泥样品中获得了4 株在培养基上产生透明圈或凹坑的菌株，并将其分别标注为LG-1、LG-2、LG-3、LG-4（见图1）。 将初筛得到的4 个菌株， 接种于卡拉胶发酵液体培养基中，利用DNS 法测定每个菌株的酶活力，以每株菌最高产酶酶活作图进行比较如图2 所示，通过DNS 法测定酶活进行复筛，可见4 个菌株都具备卡拉胶酶活力，并且得到LG-2 号菌株酶活力最强为34 U/mL，对其进行下一步试验。

图1 筛选培养基菌落Fig. 1 Colony map of screening media

图2 菌株产酶活性的筛选Fig. 2 Screening of enzyme activity in strains

2.2 LG-2 菌落及菌株形态观察

LG-2 号菌在固体种子培养基和卡拉胶培养基上生长良好，单菌落近似圆形，边缘整齐，中间隆起，呈金黄色，不透明，用接种环易于挑取，表面光滑，较湿润。 经革兰氏染色，于光学显微镜下观察，其呈革兰氏阳性，单个菌呈球状，单个散生或多个聚集（见图3）。

图3 菌株LG-2 显微形态（×1 000）Fig. 3 The micrograph of LG-2 strains

2.3 LG-2 号菌株生理生化鉴定

采用Biolog 自动微生物鉴定分析系统检测该菌对碳源的利用嗜好和对化学物质的敏感程度。 接入GenⅢ微孔板于33 ℃培养24 h， 使用Biolog Microstation 仪器进行读数。 并根据最终获得的表型同Biolog 数据库中的数据进行比较，以判断微生物的种属。

根据该菌对碳源的利用嗜好性和对化学物质的敏感程度结果，Biolog 自动微生物鉴定分析系统的鉴定结果为Rhodococcus fasciansB 菌（带化红球菌），SIM 值 为0.516，PROB 值 为0.870，Organism Type 为GP-Rod（革兰氏阳性杆菌），该结果与革兰氏染色结果一致。

该菌对蔗糖、D-果糖、肌醇、L-苹果酸、丙酸、乙酸、D-麦芽糖、明胶、柠檬酸、果胶等碳源利用较佳；化学物质敏感性试验结果表明该菌微弱耐受萘啶酮酸和氨曲南，对高盐环境、低pH 值、醋竹桃霉素和利福霉素SV 等不耐受，见表1。

表1 菌株LG-2 生理生化鉴定结果Table 1 Results of physiological and biochemical identification of strain LG-2

2.4 16S rDNA 序列分析与系统发育树的构建

菌落LG-2 经16S rDNA 测序大小为1 440 bp，如图4 所示，其PCR 产物电泳在1 000～2 000 bp 的条带之间且更靠近1 000 bp 的条带，与测序结果一致。将16S rDNA 测序结果与NCBI 数据库基因序列进行比较， 搜索得到同源性达到99%以上的菌株，均为红球菌。 结合形态学特征、培养特征和生理生化结果综合比较，确定菌株LG-2 为红球菌菌属，利用MEGA5 构建Rhodococcussp. LG-2 的系统发育树如图5 所示。 结合以往的报道，大多数产卡拉胶酶的菌属多为假单胞菌和弧菌，很少有关于红球菌属产卡拉胶酶的报道，因此该菌可进行进一步的研究与开发。

图4 LG-2 的16S rDNA 电泳图Fig. 4 Electrophoresis pattern of 16S rDNA PCR product of strain LG-2

图5 Rhodococcus sp.LG-2 的16S rDNA 的序列系统发育树Fig. 5 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of Rhodococcus sp. LG-2

2.5 LG-2 号菌株生长曲线及产酶活性曲线

根据鉴定结果选择合适培养基， 利用FP-1100-C 型Bioscreen C 分析仪测LG-2 菌株的生长曲线，并设酶活最高时的相对酶活为100%，绘制产酶活性曲线如图6 所示。 可见该菌潜伏期较短，可迅速进入对数生长期，且对数生长期较长，在培养36 h 后该菌逐渐进入稳定期，在培养54 h 后进入衰退期。 该菌随着菌株生长进入对数生长期其产酶活性快速上升，在培养22 h 时有最大产酶活性，且稳定性较好， 在培养20～28 h 内仍可保持相对酶活在80%以上，在培养48 h 后酶活急剧下降，并且随着菌株进入衰亡期产酶活性也降低至20%以下，该菌的特性有利于进行工业生产， 并且在培养20～26 h内最适合进行酶的提取。

图6 LG-2 菌株生长曲线与产酶活性曲线Fig. 6 Growth curve and enzyme production curve of LG-2 strain

3 结 语

本实验中用唯一碳源法， 从13 种来自大连不同坐标地区的海泥样品中分离产κ-卡拉胶酶的菌株，得到一株高产酶菌株LG-2，酶活为34 U/mL。后通过其形态学分析、 生理生化鉴定和16S rDNA 系统发育同源分析，初步鉴定LG-2 为红球菌属，革兰氏阳性菌。 根据菌株生长曲线及产酶活性曲线进行分析，可知该菌在培养22 h 后即可达到最高产酶活性，有利于卡拉胶酶的工业化生产。

本实验中筛选出的菌株为红球菌菌属，其产卡拉胶酶的报道较少，该菌株酶活性相对较高，经有效的重组表达后，可将其广泛地应用于卡拉寡糖的食品、药物研发与工业生产中，降低生产成本。