徐艳艳 王久江 张伶 韩昭 牛亮 张建忠 刘钊

李改静 李小兵 刘晴 刘志军 李小静

河北工程大学附属医院皮肤科，河北邯郸 056002

皮肤恶性黑素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）侵袭性强，易发生血液和淋巴管转移，5年生存率仅为10.9%，黑素瘤细胞的恶性生物学行为是影响患者预后的重要因素［1-2］。Beclin1作为自噬核心复合物关键蛋白，被认为是潜在的抑癌基因［3］。前期研究显示，Beclin1蛋白可能抑制黑素瘤瘤体生长［4-6］，苏远婷等［7］发现，黑素瘤组织Beclin1蛋白表达低于黑素瘤周边的正常表皮细胞。本实验中我们以上调Beclin1表达水平为切入点，在细胞水平上进一步探讨Beclin1对黑素瘤的影响，以期对开发针对恶性黑素瘤的靶向药物奠定实验基础。

材料与方法

一、主要材料

人黑素瘤细胞株A375、SK-MEL-2来自中国医学科学院细胞库。Beclin1抗体产自英国Abcam公司；羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶产自美国Abbkille公司；全蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶配制试剂盒均为上海碧云天生物技术公司产品；转染所用质粒pcDNA.3.1/myc-His（-）A、pcDNA3.1-Beclin1质粒均由中国凯基生物有限公司构建并测序，Beclin1基因编号为AF139131.1；转染试剂Lipo3000为美国Invitrogen公司产品；Transwell小室为美国Corning公司产品；CCK8试剂盒为日本Dojindo Laboratories公司产品。

二、方法

1.细胞准备：取出冻存的人黑素瘤细胞株A375、SK-MEL-2复苏，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中常规培养和传代，培养至2代以上消化吹打混匀成细胞悬液。

2.Western印迹筛选低表达Beclin1的黑素瘤细胞株：取上述细胞悬液离心后弃上清液，37℃消化。取细胞悬液洗涤后裂解细胞，离心15 min，取上清液用BCA蛋白含量检测试剂盒测定样品蛋白浓度。……