李北宁，于娟

慢性淋巴细胞性甲状腺炎（chronic lymphocytic thyroiditis，CLT）又被称为桥本甲状腺炎，是临床上常见的自身免疫性疾病［1］。其以甲状腺组织中不同程度的T、B 淋巴细胞浸润、滤泡细胞破坏为特征［2］。近年来CLT 的发病率在不断增加，其中尤以女性多见，给病人的身心健康带来了严重的伤害。细胞自噬在免疫性疾病中扮演着重要角色，是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，这一特定的过程是细胞存活、分化、发育以及维持内环境稳定的重要机制，在生理和病理过程中较为常见［3］。尽管大量研究结果显示，自噬在多种自身免疫性疾病中发挥重要致病作用，但是自噬在CLT中的致病机制未见报道。甲状腺滤泡细胞是甲状腺素（T4）合成的重要场所，主要将甲状腺细胞中合成的甲状腺球蛋白（Tg）吞入胞内，在蛋白水解酶作用下释放T4 和三碘甲状腺原氨酸（T3），进入血液［4］。CLT病理变化特征之一即甲状腺滤泡细胞破坏，且近年来越来越多的研究关注甲状腺滤泡细胞在CLT 发病过程中的作用。有研究表明，外周血单个核细胞中干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）在自身免疫性甲状腺疾病和正常对照组差异无统计学意义［5］，但在甲状腺组织局部IFN-γ 的表达尚无相关文献报道。故本研究旨在探讨IFN-γ是否对甲状腺滤泡细胞自噬参与CLT 具有调控作用，IFN-γ 是否可以调控甲状腺细胞自噬，从而导致甲状腺功能低下，以期深入了解IFN-γ 在CLT 发生和发展中的作用及意义。本研究在前期研究的基础上以甲状腺滤泡细胞为依托，观察自噬在CLT 中的作用。并提出两个假设：（1）CLT中甲状腺滤泡细胞自噬活性升高/降低；（2）炎症细胞因子IFN-γ 对甲状腺滤泡细胞自噬有诱导/抑制作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2018 年1—7 月，收集新疆喀什地区第二人民医院24 例CLT 手术切除病人的甲状腺组织标本作为CLT组，以及24例单纯甲状腺肿（Simple Goiter，SG）手术切除病人的甲状腺组织作为SG组（均经病理证实）。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，并得到病人知情同意。离体后半小时内立即进行处理并用于分析。两组受试者性别（SG 组：男/女＝12/12；CLT 组：男/女＝11/13）、年龄［SG 组：（45.72±5.23）岁；CLT 组：（46.89±6.15）岁］差异无统计学意义（P＞0.05），故排除上述因素对试验结果造成的影响，数据具有可比性。

自噬相关抗体兔抗微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC-3）抗体、兔抗哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抗体、兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine-aspartic acid protease-3，caspase-3）抗体，兔抗β-肌动蛋白（β-actin）抗体均购于Cell Signaling 公司。RPMI1640 培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购于Gibco 公司。辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔抗体购于圣克鲁斯生物技术公司（Santa Cruz 公司）。全蛋白提取试剂盒购于默克密里博公司。

1.2 研究方法

1.2.1 分离、培养、鉴定人甲状腺滤泡细胞 常规甲状腺滤泡上皮细胞原代培养，调整细胞浓度为2×105/mL，分成6组接种于24孔培养板上（每组复孔4个），每孔加入细胞悬液0.5 mL。置于含有100 mL/L胎牛血清的培养基中（含有100 IU/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素），37 ℃，5%二氧化碳培养箱中培养2 d，观察细胞贴壁后继续培养3 d，隔日换液1 次，去除未贴壁的甲状腺滤泡上皮细胞。1 000 r/mim 离心5 min，倒去上清液，得到细胞沉淀。上清液置于4 ℃冰箱保存待测，沉淀于倒置显微镜观察。

1.2.2 CLT、SG 病人血液收集 手术切除甲状腺组织前一周，抽取病人血液1mL，置室温下静置2 h后，于4 ℃离心机中3 000 r/min，离心10 min，吸取上清液，置于4 ℃冰箱待测。

1.2.3 流式细胞技术检测甲状腺滤泡细胞CD3+占比 病人甲状腺滤泡上皮细胞经1.2.2处理后，吸去培养液后用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤3遍，刮下贴壁细胞，加入少许PBS液移入离心管，1 500 r/min，离心30 min，吸弃上清留取细胞团块。加入染色缓冲液（Staining Buffer）1 mL 重悬沉淀，以1 200 r/min 离心5 min，弃去上清液，再加100 mL Staining Buffer重悬，即得甲状腺滤泡上皮细胞悬液。于细胞悬液中加入1 mL CD3-APC 抗体，避光孵育30 min；1 200 r/min，离心5 min，弃去上清，得细胞沉淀；后加入1 mL Staining Buffer 重悬沉淀，重复上述步骤后，200 mL Staining Buffer重悬，于冰上备用待上机检测。

1.2.4 三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）、甲状腺球蛋白（Tg）、IFN-γ 及环磷酸腺苷（cAMP）测定 取出1.2.1 处理的甲状腺滤泡细胞和1.2.2 处理的SG 病人血液；采用放射性免疫法测定培养液中T3、T4 及Tg；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定培养液中IFN-γ及cAMP。严格按照说明书操作，每组测10个复孔，取平均值。ELISA试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司。

1.2.5 蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白Becline、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）、mTOR蛋白的表达 病人甲状腺滤泡上皮细胞经3 g/L 胰蛋白酶消化后，加入2 倍体积的PBS 吹打，250 r/min，离心5 min，重复洗涤3次。按照107/mL的比例加入细胞裂解液充分裂解，5 000 r/min，离心20 min，取上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），电转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上；50 g/L 牛血清白蛋白，37 ℃封闭1 h，加入兔抗人Becline抗体（1∶1 000），兔抗人mTOR 抗体（1∶1 000）、兔抗人LC3 抗体（1∶1 000）、兔抗人β-actin（1∶1 000）抗体，4 ℃摇床轻微震荡孵育过夜；等渗缓冲盐溶液（TBST）洗涤后，再加入HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶5 000），37 ℃震荡孵育1 h；TBST 洗涤后，ECL 曝光显影鉴定。用AlphaView 图像分析软件分析，计算各蛋白条带的吸光度值，以目的蛋白与内参的吸光度比值表示其蛋白表达水平。

1.2.6 不同浓度的IFN-γ对甲状腺滤泡细胞自噬调控作用的观测设计 待病人甲状腺滤泡上皮细胞进入对数期，分别用不同浓度的IFN-γ（250、500、1 000 U/mL）处理24 h，设为IFN-γ刺激组，未经IFNγ作用的甲状腺滤泡细胞，设为对照组，收集细胞用于后期检测。蛋白质印迹法法检测自噬标志蛋白Becline、LC3B-Ⅱ、mTOR表达。

1.3 统计学方法 本研究中数据全部采用SPSS 20.0统计分析软件进行处理。计量资料采用表示，组间比较采用两独立样本t检验或单因素方差分析+组间两两比较LSD-t检验。P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分离、培养、鉴定人甲状腺滤泡上皮细胞 成功分离出人甲状腺滤泡上皮细胞，倒置显微镜下观察，可见人甲状腺滤泡细胞在贴壁之前呈圆形或椭圆形或不规则形状，CLT 病人组织切片可见多个淋巴生发中心，大量淋巴细胞浸润，甲状腺滤泡细胞萎缩。SG 病人甲状腺组织甲状腺滤泡细胞未见明显炎症浸润。

2.2 流式细胞术检测甲状腺滤泡细胞CD3+占比流式细胞分析结果显示，CLT 组甲状腺滤泡上皮细胞内浸润的CD3+淋巴细胞数所占百分比（25.76±4.05）%明显高于SG 组（10.35±4.21）%，两组间比较差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.3 T3、T4、Tg、IFN-γ 及cAMP 测定结果 甲状腺滤泡上皮细胞与血清T3、T4、Tg、INF-γ 及cAMP水平测定结果如下，由下表可见与SG 组比较，CLT组中T3、T4、Tg、INF-γ 及cAMP 水平均升高，差异有统计学意义。见表1，2。

表1 慢性淋巴细胞性甲状腺炎（CLT）组与单纯甲状腺肿（SG）组甲状腺组织中三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）、甲状腺球蛋白（Tg）、干扰素-γ（IFN-γ）及环磷酸腺苷（cAMP）水平/

表1 慢性淋巴细胞性甲状腺炎（CLT）组与单纯甲状腺肿（SG）组甲状腺组织中三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）、甲状腺球蛋白（Tg）、干扰素-γ（IFN-γ）及环磷酸腺苷（cAMP）水平/

表2 慢性淋巴细胞性甲状腺炎（CLT）组与单纯甲状腺肿（SG）组血清三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）、甲状腺球蛋白（Tg）、干扰素-γ（IFN-γ）及环磷酸腺苷（cAMP）水平/

表2 慢性淋巴细胞性甲状腺炎（CLT）组与单纯甲状腺肿（SG）组血清三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）、甲状腺球蛋白（Tg）、干扰素-γ（IFN-γ）及环磷酸腺苷（cAMP）水平/

2.4 蛋白质印迹法检测Becline、LC3B-Ⅱ、mTOR蛋白的表达 蛋白质印迹法对24例CLT及24例SG甲状腺组织中Becline、LC3B-Ⅱ、mTOR 蛋白表达水平检测，结果显示CLT组织与SG组织相比自噬水平低下，表现为Becline，LC3B-Ⅱ蛋白低表达，mTOR蛋白高表达。见表3，图1。

表3 慢性淋巴细胞性甲状腺炎（CLT）组与单纯甲状腺肿（SG）组自噬相关蛋白Becline、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表达/

表3 慢性淋巴细胞性甲状腺炎（CLT）组与单纯甲状腺肿（SG）组自噬相关蛋白Becline、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表达/

图1 蛋白质印迹法检测慢性淋巴细胞性甲状腺炎（CLT）组与单纯甲状腺肿（SG）组自噬相关蛋白Becline、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表达

2.5 不同浓度的IFN-γ 对甲状腺滤泡细胞自噬蛋白影响 分别用不同浓度IFN-γ（250、500、1 000 U/mL）处理甲状腺滤泡细胞24 h，蛋白质印迹法检测甲状腺滤泡细胞Becline，LC3B-Ⅱ，mTOR 蛋白的表达。结果显示IFN-γ 干预后，甲状腺滤泡细胞中自噬蛋白Becline，mTOR，LC3B-Ⅱ被诱导，表现为Becline，LC3B-Ⅱ水平高表达，mTOR水平低表达，且随着IFN-γ浓度的增加，诱导作用愈明显。见图2，表4。

图2 蛋白质印迹法检测不同浓度的干扰素-γ（IFN-γ）对慢性淋巴细胞性甲状腺炎（CLT）滤泡细胞自噬相关蛋白Becline、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）表达

表4 不同浓度的干扰素-γ（IFN-γ）对慢性淋巴细胞性甲状腺炎（CLT）滤泡细胞自噬相关蛋白Becline、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）表达影响/

表4 不同浓度的干扰素-γ（IFN-γ）对慢性淋巴细胞性甲状腺炎（CLT）滤泡细胞自噬相关蛋白Becline、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）表达影响/

注：与IFN-γ未干预组（0 U/mL组）CLT比较，aP＜0.05，bP＜0.01

3 讨论

自身免疫性甲状腺疾病包括毒性弥漫性甲状腺肿（Graves 病）和CLT，以产生抗促甲状腺激素受体抗体（TSHR-Ab）、抗甲状腺球蛋白抗体（TG-Ab）等自身抗体为特征，但确切的机制并不十分清楚［6-7］。已有文献报道Th1 型淋巴细胞及其分泌的细胞因子是CLT 的重要致病因素［8-9］。亦有研究表明自噬在营养缺乏、低氧应激、炎症反应、药物诱导时出现，在自身免疫性疾病中发挥重要作用，对细胞自我更新和内环境稳态的维持起重要作用［10］。本研究在于探讨自噬对CLT的作用及Th1细胞炎性因子IFN-γ对自噬介导CLT的调控作用。结果成功分离鉴定出人甲状腺滤泡细胞，流式细胞术检测到与SG 相比，CLT 组织中CD3+T 淋巴细胞数显著升高；CLT甲状腺滤泡细胞及血清中T3、T4、Tg、Th1细胞因子IFN-γ、cAMP 水平显著升高；与SG 组相比，Hashimo 甲状腺炎甲状腺滤泡细胞自噬水平低下，表现为Becline、LC3B-Ⅱ蛋白低表达，mTOR 蛋白高表达；IFN-γ可诱导甲状腺滤泡细胞自噬增加，表现为上述3 种自噬相关蛋白表达的逆转，且这种逆转作用与IFN-γ呈浓度依赖性。由此可见甲状腺滤泡细胞自噬参与CLT 的发展，且作用机制可能与炎性因子IFN-γ有关。

Becline 和LC3 与自噬体的形成有关，测定自噬相关基因Becline和LC3B的表达广泛用于检测自噬体的数量，且可靠性较高［11-13］。但目前对于CLT 中自噬相关基因Becline，LC3 的研究还未见报道。mTOR与细胞内蛋白质、核酸等物质代谢以及能量、生长因子等信号整合相关。自噬作为细胞物质代谢的方式之一，mTOR在其调节中占据重要的位置，参与调控自噬的主要通路，具有“门控”作用［14］。Pattingre S 等［15］团队研究发现，当能量或营养物质缺乏时，mTOR的活性会受到抑制，自噬水平升高以改善细胞能量状态；反之能量或营养充足时，mTOR被激活，自噬通路受阻，自噬水平下调。Meijer AJ等［16］研究表明活化的mTOR 能够减少自噬泡的形成。本研究结果显示，CLT 组Becline 和LC3B-Ⅱ的表达较对照组降低，mTOR表达较对照组升高，与文献［17］报道一致。

IFN-γ 是一种多功能的细胞因子，具有强效促炎作用，在多种疾病中显著增加，并且与疾病的发生发展有紧密联系［18-20］。有研究表明IFN-γ 可以增强甲状腺上皮细胞HLA-Ⅱ类抗原的表达，触发自身免疫的发生，激活并趋化大量的单核T 淋巴细胞进入甲状腺内，增强细胞毒性作用，促进自身抗体的产生。本研究结果显示，CLT 组织中CD3+T 淋巴细胞表达显著增加，且甲状腺滤泡细胞及血清中IFN-γ表达亦显著升高，提示Th1细胞分化上调。

IFN-γ 不仅具有较强的促炎作用，还是一种强效的细胞自噬诱导因子，能够诱导多种细胞的自噬活化，但是IFN-γ 对CLT 甲状腺滤泡细胞的自噬活性还未见报道。本研究结果显示IFN-γ可诱导CLT甲状腺滤泡细胞的活化，在CLT 中扮演重要角色。推测IFN-γ 抑制剂可能成为CLT 治疗靶标，但还有待进一步研究。

综上所述，本研究探讨了CLT 中自噬表达及IFN-γ诱导CLT甲状腺滤泡细胞自噬的作用，为CLT进一步研究提供了基础。但是IFN-γ诱导CLT甲状腺滤泡细胞自噬并不清楚，后期还需进一步研究。