张恒威，王新军，付旭东，周少龙，杨卓，张旭阳，曾凡涛，刘婉清

（郑州大学第五附属医院 神经外科，河南 郑州）

0 引言

脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的肿瘤，发病率高、死亡率高[1]。目前胶质瘤的发病机制尚不明确，临床上胶质瘤患者的治疗效果并不理想[2]。神经前体细胞表达下调因子 8(neural precursor cell-expressed developmentally down regulated 8，NEDD8)是机体内一种具有重要功能有类泛素蛋白。NEDD8通过一系列酶促反应后可与底物蛋白共价结合，调节底物蛋白生物性质，这一过程称之为Neddylation[3]。大量研究证实，NEDD8的过表达与人类多种恶性肿瘤的发生、发展有关，如多发性骨髓瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等[4]。程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1， PD-L1)是位于人染色体9q24的跨膜蛋白,是B细胞、T细胞及单核细胞表面程序性死亡分子1(programmed death-1 PD1)的配体[5]。已有研究表明，PD-L1在多种恶性肿瘤中高表达,并通过激活PD1/PD-L1信号通路减弱机体免疫细胞的致死率，使恶性肿瘤细胞躲过机体免疫系统的监控和杀伤，从而增进肿瘤的发生和发展，如肺癌、肝癌、乳腺癌等[6]。目前关于NEDD8和PD-L1在脑胶质瘤组织中表达情况的报道不多，对于二者在脑胶质瘤组织中的表达是否存在相关性的探索更少。本研究旨在通过对NEDD8和PD-L1在80例不同级别胶质瘤组织标本及30例减压脑组织标本中的表达情况的分析，进一步的揭示，NEDD8和PD-L1在胶质瘤的发生、发展中所起的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性收集2015年01月01日至2018年03月01日在郑州大学第五附属医院神经外科接受手术治疗的80位胶质瘤患者的石蜡标本。纳入标准:①初发病例且首次手术治疗；②手术治疗前未接受放射性疗、化疗及免疫治疗；③所有标本均经病理学确诊为胶质瘤，且患者临床资料完整。排除标准：①患者或患者家属拒绝参与研究；②各种原因导致的患者胶质瘤标本丢失。80位患者中男 46例，女 34 例；中位年龄 40(17～78)岁，其中＜40岁29例，≥40岁51例；患者术前头颅MRI显示：21例肿瘤位于枕叶，22例位于颞叶，37例位于额叶；80例胶质瘤组织标本，参照2007版世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类系统，星型胶质细胞瘤33例，少突胶质细胞瘤25例，胶母细胞瘤22例。低级别胶质瘤(1ow grade gliomas，LOG)27例，高 级 别 胶 质 瘤(high grade gliomas，HGG)53例。另选取同期因颅脑损伤于该院行“去骨瓣减压术”的30位患者的减压脑组织作为对照。标本取得后置于-800C冰箱冷冻保存。本研究经郑州大学第五附属医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 主要试剂和仪器

NEDD8兔单克隆抗体购于北京索莱宝科技有限公司（货号BS-10222R）、兔多克隆抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司（货号PV-900）；PD-L1兔单克隆抗体购于Cell Signaling公司(货号13684T)、兔多克隆抗体CMTM6购于Abcam公司(货号ab198284)，二氨基联苯胺(DAB)显色液、NC膜等实验试剂均购于武汉赛维尔生物有限公司。

1.3 免疫组织化学法检测胶质瘤组织及对照脑组织NEDD8和PD-L1表达

取手术切除对照脑组织常规制作石蜡标本。胶质瘤石蜡标本与对照脑组织石蜡标本5μm厚连续切片。切片贴敷于经过防脱剂处理过的载玻片上，滴加NEDD8和PD-L1单克隆抗体，4℃孵育过夜；PBS洗涤，滴加多克隆抗体；室温孵育30min后再次使用PBS冲洗，然后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液；室温下再次孵育30min后加二氨基联苯胺显色液显色，冲洗后苏木素复染，采用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。用PBS液染色替换一抗，做阴性对照切片。切片制作全部完成后，置于显微镜下观察。在常规显微镜视野（×200）下，选择每张切片免疫应答最典型区域，并在高倍视野（×400）中随机观察5个非重复视野。计数 NEDD8和PD-L1染色细胞及视野中全部细胞数。其中阳性细胞百分比≤25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%为4分；根据染色程度评分：阴性者0分，淡黄色者1分，黄色或棕黄色者2分，褐色者3分。最后以两者评分的总和为最终评分，2～6分为阳性，否则为阴性。

1.4 Western Blot检测胶质瘤组织NEDD8和PD-L1表达

取冰冻组织 300 mg切碎，置于匀浆器中以充分裂解组织中的NEDD8和PD-L1，以Western Blot标准操作步骤进行，检测出NEDD8和PD-L1表达量。实验重复3次。

1.5 统计学方法

所有数据分析由SPSS 22.0软件完成。计量资料用平均数±标准偏差）表示。NEDD8和PD-L1在试验组与对照组脑组织中阳性表达率采用χ2检验比较；两独立样本t检验用于比较不同病理级别胶质瘤NEDD8和PD-L1表达；采用χ2检验或Fisher精确概率法分析试验组NEDD8和PD-L1表达与患者年龄、性别、胶质瘤病理类型、胶质瘤位置、胶质瘤直径、胶质瘤病理级别的关系；利用列联系数分析试验组胶质瘤组织中 NEDD8和PD-L1表达的关联性。检验水准均为a=0.05。

2 结果

2.1 免疫组织化学法检测NEDD8和PD-L1的表达

NEDD8在细胞质和细胞核中都有表达，显微镜下观察，阳性细胞染色呈淡黄色至棕褐色不等。PD-L1表达于细胞质和细胞膜，显微镜下观察，阳性细胞染色亦是呈淡黄色至棕褐色不等。试验组NEDD8和PD-L1阳性表达率分别为85.00%，78.75%，对照组NEDD8和PD-L1阳性表达率分别为30.00%，13.33%，由此可见NEDD8和PD-L1在胶质瘤组织中的表达明显高于在对照脑组织中的表达（P均＜0.001），如图1、表1。

表1 NEDD8和PD-L1在对照脑组织和胶质瘤组织中的表达情况

2.2 Western Blot检测NEDD8和PD-L1表达

如图2、表2所示，HGG组NEDD8和PD-L1表达水平高于LOG组的表达水平(P均＜0.001)。

图1 不同病理级别胶质瘤组织和对照脑组织中NEDD8和PD-L1 的表达（SP,×400）A: 对照脑组织NEDD8表达; B:低级别胶质瘤NEDD8表达; C:高级别胶质瘤NEDD8表达; D: 对照脑组织PD-L1表达; E:低级别胶质瘤PD-L1表达; F: 高级别胶质瘤PD-L1表达

图2 不同病理级别胶质瘤组织中NEDD8和PD-L1的表达

表2不同病理级别胶质瘤组织中 NEDD8和PD-L1 表达水平

2.3 试验组胶质瘤组织中NEDD8和PD-L1的表达与相关临床因素的关系

经过分析，试验组胶质瘤组织中NEDD8和PD-L1的表达与胶质瘤病理级别、肿瘤直径有关系（P均＜0.05），而与病人年龄，性别，肿瘤部位，肿瘤细胞类型均无关系（P均＞0.05）。随着胶质瘤病理级别升高、肿瘤直径增大，NEDD8和PD-L1的阳性表达率均增高（P均＜0.05），如表3所示。

2.4 试验组胶质瘤组织中 NEDD8和PD-L1表达水平的关联性

试验组胶质瘤组织中NEDD8表达水平与 PD-L1 表达水平呈正相关，如表4所示。

表4 试验组胶质瘤组织中NEDD8和PD-L1 表达水平的关联性分析

3 讨论

胶质瘤是神经胶质细胞恶性肿瘤，具有高组织学异质性和组织侵袭性等特征，胶质瘤多数发展为弥漫性肿瘤，广泛浸润脑实质，严重影响患者脑功能，最终危及患者生命[7]。目前胶质瘤的治疗选择有限，对新诊断的胶质瘤常行最大安全范围的手术切除，辅以放疗、化疗。由于胶质瘤浸润能力强，常无法完全清除，致使肿瘤极易复发，患者最终预后较差，尤以胶质母细胞瘤预后最差，中位生存时间为12-15个月，5年生存率仅为5%[8]。NEDD8和PD-L1可能作为重要因素协同参与胶质瘤的发生、发展。

类泛素蛋白（Ubiquitin-like proteins，UBLs）是机体内一类有重要功能的蛋白质，具有与泛素类似的序列和空间结构。泛素及类泛素蛋白参与的翻译后修饰过程，几乎贯穿于细胞内的所有调控途径[9]。神经前体细胞表达下调因子 8(NEDD8)是由81个氨基酸编码的类泛素蛋白，是目前研究发现的与泛素最近似的蛋白[10]。正常细胞生理过程中，NEDD8的主要功能是保持蛋白质的稳定性、增强或者减弱其特异性底物蛋白的活性和参与转录的调节等[11]。研究表明，NEDD8的底物中包含多种肿瘤相关蛋白、抑癌因子、调控基因表达过程的转录因子，如p53、鼠双微体基因（murine double mimute2，MDM2）、希佩尔林道基因（Von Hippel-l indau，VHL）和 Cullin 家 族（Cul-lin-Ring E3 ligases，CRLs）等，NEDD8过表达会造成肝癌、乳腺癌、肺癌等的发生、发展[12]。

近几年，关于肿瘤细胞如何引起免疫逃逸的相关机制研究，取得了很多突破性的进展，其中PD-1/PD-L1途径是众多成果中研究相对较深的机制之一[13]。PD-L1由机体CD274基因编码，是程序性死亡分子1(programmed death-1 PD1)的配体。生理情况下PD-L1 与 PD-1 结合后，PD-1向机体免疫系统递送抑制性信号，调节淋巴细胞的功能，防治自身淋巴细胞攻击自身抗原，避免自身免疫性疾病的发生[14]。肿瘤细胞高表达PD-L1，通过激活此通路，抑制T淋巴细胞增殖，促进调节性T细胞( regulatory T cell，Treg)的生成，进而达到抑制机体免疫系统的目的[15～16]。目前Treg细胞在肿瘤组织中所起的作用很受关注，有研究报道Treg细胞可以导致免疫抑制、免疫无功能，进而促进多种癌细胞的生长和转移[17]。

本研究表明，NEDD8和PD-L1在试验组胶质瘤组织中高表达，随着胶质瘤病理级别升高、肿瘤直径的增大表达上调更明显，且试验组胶质瘤组织NEDD8表达水平与 PD-L1 表达水平呈正相关。由此我们猜测NEDD8和PD-L1高表达协同促进胶质瘤的恶变以及向周围侵袭性生长，NEDD8和PD-L1可能作为重要的因素参与胶质瘤的发生、发展，二者有可能成为衡量胶质瘤恶性程度的蛋白标志物。大量研究报道揭示，NEDD8活化酶E1 有希望成为抗肿瘤药物的新靶点，其中MLN4924作为 NEDD8 修饰的特异性抑制剂，已在临床上证实可以抑制结肠癌、肺癌、多发性骨髓癌等多种肿瘤细胞的恶性生长[18]。同样以PD-L1为靶点的靶向药物，已在临床上开始应用，且已经证实对肾癌、宫颈癌、非小细胞癌患者有效[19]。目前我们研究团队已经证实[20]，动物及体外实验中，通过减少NEDD8和PD-L1的表达，能有效的抑制胶质瘤细胞的生长、增殖，协同使用NEDD8和PD-L1抑制剂，胶质瘤受抑制效果更加显著。临床上能否通过抑制NEDD8和PD-L1高表达，使胶质瘤患者预后得到良好改善，需要进一步的探索。

综上所述，此次研究主要探讨了NEDD8和PD-L1在胶质瘤中的表达情况及与相关临床因素的关系，未涉及NEDD8和PD-L1影响胶质瘤发生、发展的具体机制，后续会做进一步探索加以阐明。下一步将首先从NEDD8和PD-L1对胶质瘤患者预后的影响着手开始新的研究，更深层次的发掘NEDD8和PD-L1的临床应用价值。