魏 蔷，白怡霖,2，柴书军，刘运超，宋亚鹏，张改平，3，4

(1.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002； 2.西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨陵 712100；3.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002； 4.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

猪瘟(Classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起的一种以猪的高热和出血为特征的高度接触性传染病，对世界养猪业造成了严重危害。CSFV是黄病毒科瘟病毒属的成员，其基因组为长约 12.3 kb的线状单股正链RNA，含有单一的开放阅读框，编码1个约3 900个氨基酸残基组成的多聚蛋白，其在多种蛋白酶作用下最终裂解为4个结构蛋白(包括核衣壳蛋白C、E1、E2及Erns)与8个非结构蛋白(包括p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B及Npro)[1-2]。其中，E2 蛋白存在于病毒囊膜表面，为 CSFV的主要保护性抗原，参与病毒的感染过程并诱导机体产生中和抗体[3-4]。Erns蛋白是仅次于 E2 的免疫原性糖蛋白，也能刺激机体产生中和抗体。Erns蛋白全长包含227个氨基酸，共有7个糖基化位点[5-6]。Erns蛋白没有跨膜结构，但在其C端具有1个膜锚定结构，因此，它与病毒间结合力度较弱，很容易从病毒颗粒上脱落[7-8]。此外，Erns蛋白具有RNA酶活性，能够降解宿主细胞及病毒中的RNA，在整个病毒复制进程中表现出不同的生物活性[9-10]。

目前，控制CSFV流行的主要策略是系统化的预防接种和其他防控措施，如消毒、检疫、隔离、无害化处理等，而疫苗接种一直受到世界各国的广泛重视[3]。E2亚单位疫苗仅含病毒的保护性抗原，不含病毒的其他组成成分，与活疫苗相比具有安全性好、稳定性强的特点。此外，E2亚单位疫苗在临床应用时具有很大的优势，即接种后能够区分疫苗免疫和野毒感染，从而有利于在临床实践中进行快速筛查[11]。制备Erns抗体的检测试剂盒，可以配合E2亚单位疫苗使用，用于检测区分E2亚单位疫苗接种猪和自然感染猪，这就需要外源表达的Erns蛋白[12]。Erns蛋白是高度糖基化的蛋白，前人研究表明，Erns的糖基化对其免疫保护效果起决定作用[13]。因此，获得正确糖基化的Erns蛋白对于 CSFV诊断方法的建立至关重要。为此，采用杆状病毒表达系统表达Erns蛋白，对表达蛋白进行分离鉴定，并对其糖基化修饰、抗原性进行分析，旨在为研制以Erns蛋白为诊断抗原的 CSFV ELISA诊断试剂盒奠定基础。

1 材料和方法

1.1 质粒、菌株及试剂

pFastBacl载体、DH10Bac感受态细胞、sf21细胞、抗CSFV阳性血清及抗CSFV阴性血清均由本实验室保存。pUC57-Erns由上海生工生物工程股份有限公司合成，并且根据昆虫细胞密码子偏好性对Erns序列进行了优化。限制性内切酶、N-糖酰胺酶F(PNGase F)NP-40购自NEB公司，羊抗猪IgG、抗His标签单克隆抗体购自Abcam公司，琼脂糖购自Sigma公司，质粒小提试剂盒购自QIAGEN公司，CellfectinⅡ购自Gibco公司，镍离子亲和填料购自GE公司，DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker均购自Takara公司，蛋白质Marker购自全式金公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 重组质粒的构建及鉴定

合成gp67信号肽正向引物：5′-ATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAGGCTTCAATAAGGAACAC-ACAAGCAAGATGGTAAGCGC-3′，反向引物：5′-CGCAAAGGCAGAATGCGCCGCCGCCGCCAAAAGCAC-

ATATAAAACAATAGCGCTTACCATCTTGC-3′，引物经Overlap PCR得到信号肽序列，将其通过同源重组方法插入pFastBacl载体得到改造载体pFastBacl-gp67。随后选取包含Erns主要抗原表位的基因序列[14](1—190位氨基酸)，经PCR扩增，上游引入BamHⅠ酶切位点(5′-GGATCCGAAAACATCACCCAGTG-3′)，下游引入XhoⅠ酶切位点及His标签(5′-CTCGAGTTAATGATGATGGTGATGGTGATGATGGATGGTGTTGGTCATGCCGTCC-3′)，PCR产物及pFastBacl载体经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后回收，使用DNA连接酶连接，构建重组质粒pFastBacl-gp67-Erns，最终产物经过PCR进行鉴定，并经DNA测序确认。

1.3 重组黏粒的制备及鉴定

将重组质粒pFastBacl-gp67-Erns转化至DH10Bac感受态细胞，进行蓝白斑筛选，37 ℃培养48 h后，挑选白色菌落于LB液体培养基，振荡培养过夜，随后使用QIAGEN质粒小提试剂盒提取重组黏粒，命名为Bacmid-Erns，使用M13通用引物进行PCR鉴定。

1.4 杆状病毒的制备及扩增

以0.8×106个/孔的细胞数将处于对数生长期的sf21细胞加入六孔板，静置使细胞充分贴壁。使用CellfectinⅡ将重组黏粒转染至贴壁sf21昆虫细胞，静置培养3～4 d，观察细胞病变情况，收取细胞培养上清作为第1代重组杆状病毒P1。随后在无菌培养皿中加入无血清培养基10 mL，加入6×106个sf21细胞，轻晃培养皿使细胞均匀分布，静置10 min，待细胞贴壁后，向其中加入800 μL P1病毒，将培养皿放入28 ℃培养箱，避光静置培养3～4 d，收获细胞培养上清，即为2代病毒P2。使用同样方法扩增，收集P3杆状病毒。

1.5 Erns蛋白的表达、纯化及鉴定

以5个感染复数的P3杆状病毒接种对数生长期的sf21细胞，培养72 h后，8 000 r/min离心20 min收集Erns分泌表达培养上清，用0.22 μm滤膜过滤后，将上清通过镍离子亲和柱亲和纯化，经不同咪唑浓度漂洗液进行梯度漂洗，包括Buffer A(20 mmol/L Tris-HCl,pH值7.5，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑)、Buffer B(20 mmol/L Tris-HCl,pH值7.5，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑)、Buffer C(20 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5，150 mmol/L NaCl，30 mmol/L咪唑)进行漂洗，随后用Buffer D(20 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5，150 mmol/L NaCl，200 mmol/L咪唑)进行洗脱，收集洗脱液。收集纯化过程中各组分，经SDS-PAGE进行分析，并使用抗CSFV阳性血清作为一抗进行Western blot 鉴定。

1.6 Erns蛋白糖基化水平鉴定

10 μL反应体系中，加入3 μg上步纯化所得Erns蛋白、1 μL 10×糖蛋白变性缓冲液和水。100 ℃煮沸10 min，使蛋白质变性。加入2 μL 10×反应缓冲液、2 μL 10% NP-40、1 μL PNGase F，加水补充反应体系至20 μL，37 ℃孵育1 h，随后经SDS-PAGE进行分析，并以抗His标签单克隆抗体为一抗进行Western blot 鉴定。

1.7 Erns蛋白抗原性的分析

将纯化的Erns蛋白稀释至5 μg/mL，每孔100 μL包被ELISA板，5%的脱脂奶粉封闭。抗CSFV阳性血清预先100倍稀释，随后以2倍倍比稀释，100 μL/孔加入ELISA板，同时设置阴性血清对照，37 ℃孵育1 h，PBST漂洗后，加入1 000倍稀释的羊抗猪IgG，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST漂洗，TMB显色后读取OD450值。

2 结果与分析

2.1 Erns蛋白表达质粒的构建及鉴定

通过Overlap PCR扩增gp67信号肽序列，将其通过同源重组方法插入pFastBacl载体，得到改造载体pFastBacl-gp67。将密码子优化后的Erns基因经PCR扩增，上游引入BamHⅠ酶切位点，下游引入XhoⅠ酶切位点，将PCR产物及pFastBacl-gp67载体经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后回收，酶切后片段及载体进行连接，构建重组质粒pFastBacl-gp67-Erns。重组质粒经PCR鉴定，结果如图1所示，目的片段的大小约为600 bp，重组质粒的PCR扩增结果符合预期，表明重组质粒制备成功。

M：DL2000 DNA Marker; 1：重组质粒pFastBacl-gp67-ErnsM：DL2000 DNA Marker; 1: Recombinant plasmid pFastBacl-gp67-Erns图1 重组质粒pFastBacl-gp67-Erns的PCR鉴定结果Fig.1 Identification result of recombinant plasmid pFastBacl-gp67-Erns by PCR

2.2 重组黏粒Bacmid-Erns的制备及鉴定

将上述所得重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑选白色菌落于LB液体培养基，振荡培养过夜，使用QIAGEN质粒小提试剂盒提取黏粒Bacmid-Erns，经M13通用引物进行PCR鉴定。鉴定结果如图2所示，对于发生转座的阳性黏粒，其目的片段大小应为2.3 kb以上，重组黏粒的PCR产物大小约为3 kb，结果符合预期，表明挑选的白斑成功发生了转座。

2.3 Erns蛋白的纯化及鉴定

使用P3病毒感染sf21细胞，72 h后，收集细胞培养上清，经镍填料进行纯化，收集纯化过程中培养液上清、流穿液、漂洗液、洗脱液组分，进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示。由纯化结果可以看出，经不同浓度梯度咪唑漂洗后，培养液上清杂蛋白得到有效去除，Erns蛋白得到有效富集、纯化，产率较高，约为40 mg/L。但是纯化所得蛋白质大小不一，其大小分布在25～35 ku，大于其理论分子质量，表明所得蛋白质可能存在糖基化等翻译后修饰，多条蛋白质条带可能对应不同的糖基化修饰水平。以抗CSFV阳性血清为一抗，Western blot 检测结果表明，纯化的Erns蛋白能与抗CSFV阳性血清产生特异性反应(图4)，说明Erns蛋白具有良好的抗原反应性。

M：蛋白质Marker；1：培养液上清；2：流穿液；3：漂洗液A；4：漂洗液B；5：漂洗液C；6：洗脱液DM: Protein Marker; 1:The fraction of supernatant; 2:The fraction of flow through; 3:The fraction of washing A; 4:The fraction of washing B;5:The fraction of washing C; 6:The fraction of elution D图3 Erns蛋白纯化结果Fig.3 Purification of Erns protein

M：蛋白质Marker；1：Erns洗脱液DM:Protein Marker; 1:The fraction of elution D图4 Erns蛋白Western blot鉴定结果Fig.4 Western blot analysis of purified Erns protein

2.4 Erns蛋白的糖基化水平分析

为验证纯化所得Erns蛋白具有糖基化修饰，利用PNGase F处理Erns蛋白，37 ℃温浴1 h后，以抗His标签单克隆抗体为一抗，进行Western blot分析。结果如图5所示，加入PNGase F后，Erns由原来的多条带变为单一条带，对应分子质量明显变小，约为20 ku，且条带明显变窄变清晰，证实Erns蛋白中含有糖基化位点，且蛋白质糖基化水平较高。

M：蛋白质Marker；1：Erns纯化样品；2：PNGase F酶处理的Erns纯化样品M:Protein Marker; 1:Purified Erns protein2:PNGase F-treated Erns图5 Erns蛋白糖基化水平分析Fig.5 Western blot analysis of the glycosylation level of Erns

2.5 Erns蛋白的抗原性分析

将纯化后的Erns蛋白以0.5 μg/孔的量包被酶标板，检测重组蛋白的抗原性。随着血清稀释度的增加，OD 值呈下降趋势，当血清1∶51 200稀释时，阳性值仍在阴性值3倍以上(图6)，表明纯化所得Erns蛋白能特异性识别抗CSFV阳性血清，且灵敏性良好。

图6 Erns蛋白抗原性分析Fig.6 Antigenicity analysis of Erns protein by ELISA

3 结论与讨论

以Erns蛋白为诊断抗原可制备CSFV ELISA诊断试剂盒，配合E2亚单位疫苗能够用来检测区分野毒感染和疫苗免疫猪，其开发应用前景较好。目前，Erns的表达主要集中于原核表达系统，其表达量较小，且不能进行翻译后修饰，目的蛋白多以包涵体形式存在，难以进行进一步处理[15]。前人利用毕赤酵母、拟南芥表达的Erns蛋白具有较好的抗原性，但未分析蛋白质的糖基化水平[16-18]。杆状病毒表达系统具有表达量高、能够对蛋白质进行必要的翻译后加工等优点，已成为目前最成功的外源蛋白表达系统之一。国内采用杆状病毒表达系统对Erns进行表达的报道较少，且缺乏对其纯化、糖基化水平的分析及进一步鉴定[19-20]。本研究克隆了包含Erns主要抗原表位的基因序列，使用杆状病毒表达系统成功得到了分泌表达的Erns蛋白，SDS-PAGE及Western blot结果均表明，得到糖基化的Erns蛋白，不同的蛋白质条带对应不同的糖基化水平。用PNGase F处理纯化所得Erns蛋白，条带变窄且蛋白质分子质量减小为约20 ku，与非糖基化Erns蛋白的理论分子质量大小一致。上述结果进一步证明，本研究所得Erns蛋白具有较高的糖基化修饰水平。

本研究中通过信号肽的加入实现Erns蛋白的分泌表达，这一方面有利于Erns蛋白的翻译后修饰，另一方面减少了杂蛋白对蛋白质纯化过程的干扰。由SDS-PAGE结果可以看出，镍填料一步纯化所得Erns蛋白纯度较高，且蛋白质回收率较高，蛋白质纯化产率达到40 mg/L。由此，本研究提高了Erns蛋白的纯化效率，节约了纯化成本。

综上，本研究利用杆状病毒表达系统成功分泌表达了Erns蛋白，在此基础上进行蛋白质的纯化，纯化所得Erns蛋白纯度较高，且具有较高的糖基化修饰水平，此外，纯化所得Erns蛋白的抗原性良好，产率较高，约为40 mg/L。