郗蓓蓓，叶建仁

(1.南京林业大学 南方现代林业协同创新中心/林学院，江苏 南京 210037；2.江苏省有害生物入侵预防与控制重点实验室，江苏 南京 210007)

钾是植物必需的大量营养元素之一，在提高作物产量[1]、改善作物品质[2]、增强作物抗逆性[3]等方面具有重要作用。我国虽然钾岩石矿物资源极为丰富，但可被植物直接吸收利用的可溶性钾含量却普遍较低[4]。目前改善土壤缺钾状况的主要途径是施用工业钾肥。然而，化肥的过量使用不仅增加生产成本，也带来耕地生态系统功能退化、土地大面积酸化等问题[5]。因此，若能通过其他方式将土壤中的矿物钾转化为可被植物直接吸收利用的速效钾，可解决我国土壤中可溶性钾缺乏的问题，同时对于生态环境的保护和资源的可持续利用也有重要意义。

微生物肥料又称菌肥、生物肥料等，是以大量活微生物菌体、一定的代谢产物和丰富的培养基质混合而成的肥料[6-7]。在我国生产应用的微生物肥料可分为固氮菌、解磷菌和钾细菌等[8-9]。其中，钾细菌又称硅酸盐细菌，是目前广泛应用于微生物肥料中的重要功能菌，可以分解土壤中含钾、铝硅酸盐矿物，有些种类不仅具有解钾功能，还具有溶磷及固氮能力[10]。钾细菌是植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria)的重要类群[11-12]。钾细菌种类很多，研究较为深入的多为芽孢杆菌(Bacillussp.)[13]。近些年，国内外学者也分离到许多其他种类的钾细菌，一些高效钾细菌已经应用到实际生产过程中。由于不同地区土壤环境中pH值、温度和微生物群落等与试验条件存在较大的差异，造成钾细菌在使用时出现效果不稳定的状况。所以分离筛选适合不同区域的高效、稳定的钾细菌菌株是现在研究热点之一。

鉴于此，以南京森林土壤为材料，从中分离筛选具有高效溶钾能力的钾细菌，根据其形态特征、生理生化指标及16S rRNA系统发育分析对钾细菌进行种类鉴定，并进一步研究其对植物的促生长作用及其生物活性，以筛选出解钾活性较强的细菌，缓解土壤缺钾状况。

1 材料和方法

1.1 试验材料

土壤采自南京森林中山杨树及构树根际。采用3点取样法，去除土壤表层植物残体后，取10～20 cm土层的土壤，3点土样混为1份，于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2 钾长石和培养基

钾长石：购于上海长哲生物，矿物样品经研磨过0.007 4 mm筛，盐酸溶液浸泡，去离子水清洗，烘干备用。

亚历山大罗夫培养基：蔗糖5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeCl30.005 g、CaCO30.1 g、Na2HPO42 g、钾长石粉1 g、去离子水1 000 mL，pH值 7.2。

发酵培养基：蔗糖10.0 g、Na2HPO41 g、MgSO4·7H2O 1 g、FeCl30.000 5 g、(NH4)2SO40.5 g、酵母0.2 g、钾长石粉12 g、去离子水1 000 mL，pH值 7.2。

1.3 钾细菌的分离和筛选

称取土样10 g加入90 mL无菌水中，30 ℃、200 r/min振荡30 min，摇散菌体，此时土壤悬浮液质量浓度为0.1 g/mL。吸出1 mL土壤悬浮液至9 mL无菌水中充分混匀，此时土壤悬浮液质量浓度为0.01 g/mL，依次稀释至土壤悬浮液为10-4、10-5、10-6g/mL。取10-4、10-5、10-6g/mL土壤悬浮液各0.1 mL涂布于事先准备的亚历山大罗夫培养基上，每个重复3皿。倒置于30 ℃恒温箱中培养5 d后，挑选出湿润、圆滑、有光泽、挑起易拉丝的菌落进行纯化。用平板划线法进行3次纯化，将分离到的菌株编号并扩大培养，保存甘油菌于-80 ℃冰箱备用。

1.4 钾细菌的解钾效果测定

将保存的甘油菌接种于LB液体培养基，30 ℃、200 r/min培养至对数生长期作为种子液。分别在250 mL三角瓶中加入100 mL发酵培养基，灭菌后，取对数生长期的菌液3 mL接入发酵培养基，每组设3个重复。并设置添加无菌水的空白对照(CK)，30 ℃、200 r/min振荡培养7 d。分别在培养0、24、48、72、96、120、144、168 h后取样，将发酵液8 000 r/min离心10 min，除去菌体和残渣，收集上清液。用pH计测量发酵液pH值，火焰分光光度法测定可溶性钾含量，比较不同菌株的解钾能力。

1.5 钾细菌形态学及生理生化分析

将5株钾细菌接种在亚历山大罗夫培养基上，30 ℃培养3～5 d，观察其菌落形态，之后进行革兰氏染色、芽孢染色及生理生化试验。

1.6 钾细菌16S rRNA分析

采用CTAB法提取5株钾细菌基因组DNA为模板，以细菌16S rRNA基因的通用引物27F和1492R进行PCR扩增。将PCR产物送公司测序，测序结果在EzBioCloud数据库中进行比对，同时递交NCBI中GenBank数据库以获得序列登录号。通过MEGA 7.0软件进行序列编辑，采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育进化树。

1.7 钾细菌对番茄种子萌发的影响

选取饱满、无病虫害的番茄种子，清水冲洗后分别浸入5株不同钾细菌发酵液中，以蒸馏水浸泡为对照(CK)，于室温浸泡12 h。浸种后弃去浸液，10% H2O2消毒后无菌蒸馏水清洗。在无菌条件下将30粒番茄种子置于水琼脂培养基(琼脂10 g、蒸馏水1 000 mL)中培养，每个处理3次重复。于30 ℃恒温培养箱中培养。以幼芽达种子长度1/2时为萌发标志，并于第7天调查种子发芽数、芽长和幼苗鲜质量。

1.8 钾细菌对番茄盆栽苗生长的影响

选取饱满、无病虫害的番茄种子，蒸馏水浸泡12 h去掉漂浮的种子和杂质。无菌蒸馏水洗净，10% H2O2消毒后播种。待幼苗长出2片真叶后，挑选大小、长势一致的幼苗移入装有500 g南大山黄棕壤土花盆(96 mm×110 mm)中，每盆移栽2株幼苗。将5株钾细菌菌株接种于LB液体培养基，30 ℃、200 r/min振荡培养至对数期，将菌悬液离心，无菌水洗涤3次后重悬。每盆加5 mL菌悬液，每10 d接菌1次，接种终含量为107cfu/g，以加入等量无菌水为对照(CK)。每个处理10次重复，随机区组排列，放置于温室且在自然光照下培养。处理40 d以后测番茄的株高、鲜质量和干质量等指标。

1.9 5株钾细菌生物活性差异检测

1.9.1 钾细菌拮抗尖孢镰刀菌和樱花根癌病菌的抑菌活性测定 采用对峙培养法检测5株钾细菌对尖孢镰刀菌的抑制作用，将尖孢镰刀菌菌盘接种到PDA平板中央。将樱花根癌病原菌混合LB固体培养基倒入培养皿。将5株钾细菌接种于LB液体培养基，培养48 h后，经过菌液离心及细菌过滤器过滤得到发酵液，取各菌株发酵液100 μL接至培养基5个圆孔中，每个处理重复3次，以只接病原菌的处理为对照(CK)，30 ℃培养至CK长满整个培养皿时观察结果。

1.9.2 钾细菌产生长素(IAA)能力测定 用比色法对5株钾细菌进行产IAA能力测定，将供试菌株发酵液离心过滤菌体，取上清液，加正磷酸和显色剂混匀，黑暗下显色，测定530 nm波长处吸光值。以IAA标准液作标准曲线，计算发酵液中IAA的含量。

1.9.3 钾细菌产蛋白酶能力测定 用蛋白酶检测培养基(脱脂奶粉10 g、牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂20 g、去离子水1 000 mL)检测5株钾细菌产蛋白酶能力。

1.9.4 钾细菌产几丁质酶能力测定 用几丁质酶检测培养基(NH4H2PO41.0 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、1%胶体几丁质、pH值 7.0、琼脂20 g、去离子水1 000 mL)检测5株钾细菌产几丁质酶能力。

1.10 数据处理

采用WPS软件进行数据表格处理，采用SPSS 19.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 土壤中钾细菌的分离

以钾长石为唯一钾源的固体培养基，从采集的土壤样本中分离到5株具有解钾活性的菌株。分别编号为SK1-7、SK2-3、SK2-7、SK3-3、SK3-10，菌株保存于南京林业大学森林病理学实验室。

2.2 5株钾细菌的解钾能力测定

为了进一步确定5株钾细菌的解钾能力，对其进行解钾效应分析。解钾培养基摇瓶培养7 d后，火焰分光光度计测定其钾离子含量。结果显示(图1)，液体摇瓶培养7 d后CK、SK1-7、SK2-3、SK2-7、SK3-3、SK3-10钾离子含量分别为13.33、42.70、50.40、49.70、41.50、45.23 μg/mL。说明5株钾细菌均有一定的解钾能力。

图1 5株钾细菌培养7 d内解钾能力的变化Fig.1 Changes of potassium-dissolving activity of 5 strains of potassium-solubilizing bacteria incubated for 7 days

培养液接种钾细菌后酸碱度均发生变化，5株钾细菌发酵液pH值在培养1 d后迅速降低，2 d后基本稳定在3.4～4.0。CK的发酵液pH值在培养7 d内一直维持在7.2左右，与接种前pH值相比无明显变化(图2)。

图2 5株钾细菌发酵液pH值的变化Fig.2 Changes of pH value in the fermentation filtrate of 5 strains of potassium-solubilizing bacteria

2.3 5株解钾细菌的种类鉴定

2.3.1 形态学及生理生化特征 5株钾细菌在亚历山大罗夫培养基培养3～5 d后，SK1-7菌落呈乳白色、近圆形、扁平、边缘不规则、表面磨砂状；SK2-3菌落呈透明圆形、扁平、边缘规则、表面光滑湿润、易挑起；SK2-7菌落呈透明圆形、凸起、边缘规则、表面光滑湿润、挑起不易拉丝；SK3-3菌落呈黄色圆形、凸起、边缘规则、表面光滑湿润、黏稠；SK3-10菌落呈透明圆形、凸起、边缘规则、表面光滑湿润、挑起易拉丝。如表1所示，5株钾细菌均为杆状，其中SK1-7、SK3-3为革兰氏阳性菌，SK2-3、SK2-7、SK3-10为革兰氏阴性菌，芽孢染色结果显示SK1-7产芽孢。生理生化特征显示(表2)，SK1-7菌株除不能利用硝酸盐为碳源，其余均为阳性反应；SK2-3菌株能够利用硝酸盐为碳源、能够产生过氧化氢酶、能够分解葡萄糖但不产气；SK2-7菌株在代谢过程中能够分解葡萄糖生成丙酮酸、能够产生酸类物质、可以利用硝酸盐为碳源、能还原硝酸盐为亚硝酸盐、具有合成淀粉酶的能力、可以利用4类糖(葡萄糖、麦芽糖、果糖和甘露醇)且产气；SK3-3菌株能够产生过氧化氢酶、可以利用4类糖(葡萄糖、麦芽糖、果糖和甘露醇)但不产气；SK3-10菌株能够分解葡萄糖生成丙酮酸、能够产生酸类物质、可以利用柠檬酸盐为碳源、具有合成淀粉酶的能力、可以利用4类糖(葡萄糖、麦芽糖、果糖和甘露醇)且产气。

表1 5株钾细菌的菌体形态学特征Tab.1 Microbial morphological characteristics of 5 strains of potassium-solubilizing bacteria

注:“+”表示反应为阳性,“-”表示反应为阴性，下同。
Note:“+” means that the reaction was positive,“-” means that the reaction was negative,the same below.

表2 5株钾细菌的生理生化特征Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of 5 strains of potassium-solubilizing bacteria

注:“0”表示反应为阳性产气。
Note: “0” means that the reaction was positive gas production.

2.3.2 16S rRNA分析 将5株钾细菌的16S rRNA测序结果提交EzBioCloud数据库中进行比对。结果表明(图3)，SK1-7与Bacillusaryabhattai聚为一支，相似度为100%；SK2-3与Ensiferadhaerens聚为一支，相似度为100%；SK2-7与Klebsiellasingaporensis聚为一支，相似度为99.29%；SK3-3与Microbacteriummaritypicum聚为一支，相似度为99.14%；SK3-10与Raoultellaornithinolytica聚为一支，相似度为99.93%。递交NCBI中GenBank数据库获得序列登录号，SK1-7为MK307632，SK2-3为MK305946，SK2-7为MK305947，SK3-3为MK305948，SK3-10为MK305949。

图3 5株钾细菌基于16S rRNA序列的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of 5 strains of potassium-solubilizing bacteria based on 16S rRNA sequence

2.4 钾细菌对番茄种子萌发的影响

钾细菌对番茄种子萌发的影响表明(表3)，SK1-7、SK2-3、SK2-7、SK3-10处理的番茄种子与CK相比，发芽率分别显著或极显著提高了26.62%、20.39%、24.51%、20.47%；SK1-7、SK2-3、SK2-7、SK3-10处理的番茄种子萌发后的茎长分别比CK显著或极显著提高了17.76%、42.11%、47.37%、32.24%；SK2-3、SK3-10处理的番茄种子萌发后的根长分别比CK极显著、显著提高了25.38%、32.42%；SK2-3、SK2-7、SK3-10处理的番茄种子萌发长成的植株鲜质量分别比CK显著或极显著提高了24.23%、38.17%、19.52%。

表3 5株钾细菌对番茄种子萌发的影响Tab.3 Effects of 5 strains of potassium-solubilizing bacteria on germination of tomato seeds

注：*、**分别表示差异显者(P<0.05)、极显著(P<0.01)，下同。
Note:*、**indicates differences are significant(P<0.05),extremely significant(P<0.01),the same below.

2.5 钾细菌对番茄的促生效应

5株钾细菌对番茄的促生效应表明(表4)，SK1-7、SK2-3、SK2-7对番茄植株有显著或极显著的促生作用。与CK相比，SK1-7、SK2-3、SK2-7处理的番茄植株的株高分别极显著提高了37.62%、23.53%、38.24%；鲜质量分别提高了36.96%、31.81%、20.58%；干质量分别显著或极显著提高了27.27%、16.25%、14.56%。

2.6 5株钾细菌生物活性差异检测

2.6.1 5株钾细菌对尖孢镰刀菌和樱花根癌病菌的抑菌作用测定 SK2-7、SK3-10菌株对尖孢镰刀菌及樱花根癌病菌有明显的抑菌作用，SK2-7对尖孢镰刀菌抑制作用较强(图4)，SK3-10对樱花根癌病菌抑制作用较强(图5)。

2.6.2 钾细菌产生IAA能力测定 钾细菌发酵滤液粉红色越深则表明IAA含量越高，5株钾细菌均有IAA产生，其中，SK2-7产IAA能力最强，IAA含量为19.5 μg/mL；SK1-7其次，IAA含量为15.1 μg/mL；SK2-3、SK3-3、SK3-10发酵液IAA含量分别为5.2、6.8、5.9 μg/mL (图6)。

表4 5株钾细菌对番茄的促生作用Tab.4 The promoting effect of 5 strains of potassium-solubilizing bacteria on tomato

图4 5株钾细菌对尖孢镰刀菌的抑制作用Fig.4 Inhibition of 5 strains of potassium-solubilizing bacteria on Fusarium oxysporum

图5 5株钾细菌对樱花根癌病菌的抑制作用Fig.5 Inhibition of 5 strains of potassium-solubilizing bacteria on Agrobacterium tumefaciens

图6 5株钾细菌产IAA能力测定Fig.6 Determination of IAA-producing ability of 5 strains of potassium-solubilizing bacteria

2.6.3 钾细菌产蛋白酶能力测定 将5株钾细菌接种在蛋白酶培养基上，只有SK1-7有酶解圈产生，具有分泌蛋白酶能力(图7)。

图7 5株钾细菌产蛋白酶能力测定Fig.7 Determination of protease-producing ability of 5 strains of potassium-solubilizing bacteria

2.6.4 钾细菌产几丁质酶能力测定 5株钾细菌均能在几丁质酶平板上生长，但均无透明圈产生，因此，5株钾细菌均不产几丁质酶(图8)。

图8 5株钾细菌产几丁质酶能力测定Fig.8 Determination of chitinase-producing ability of 5 strains of potassium-solubilizing bacteria

3 结论与讨论

钾是植物生长发育所必须的大量元素，参与细胞多种生命活动，对植物生长发育具有重要作用。土壤中90%的钾存在于钾长石及云母等硅酸盐矿物中，可被植物直接吸收利用的速效钾相对匮乏。钾细菌是目前广泛应用于微生物肥料中的重要功能菌，可以分解土壤中含钾铝硅酸盐矿物，增加土壤中可溶性钾含量。本研究从南京森林土壤中筛选到5株钾细菌(Bacillusaryabhattai、Ensiferadhaerens、Klebsiellasingaporensis、Microbacteriummaritypicum、Raoultellaornithinolytica)。筛选结果与HU等[14]从浙江天目山筛选出的B.mucilaginosus及吴凡等[15]从桑树根际分离筛选到的Pseudomonassp.、Sinorhizobiumsp.、Rhizobiumsp.、Mesorhizobiumsp.、Flexibactersp.有所不同，说明不同地区、不同土壤类型中钾细菌种类有一定的差别。

YAGHOUBI等[16]筛选的3株钾细菌，在以云母为唯一钾源的培养基中培养21 d后，其释放的钾量分别为35.36、76.04、56.58 μg/mL。袁文功等[17]从昆明白泥山土壤样品中分离获得硅酸盐细菌Paenibacillussp.BN1，对云母具有较强的解钾活性，解钾量是对照的1.79倍。本研究筛选的5株钾细菌在以钾长石为唯一钾源的液体培养基培养7 d，SK1-7、SK2-3、SK2-7、SK3-3、SK3-10发酵液中的速效钾含量分别为42.70、50.40、49.70、41.50、45.23 μg/mL，均高于对照，具有较强的解钾能力。钾细菌培养7 d后发酵液pH值大幅降低，最终维持在3.4～4.0。此结果与谢庆东等[18]在钾长石存在条件下接种钾细菌，培养7 d后发酵液pH值为3.62～3.80一致。由此推测，5株钾细菌在以钾长石为唯一钾源的贫瘠培养基中，可能通过细菌活动分泌次生代谢物降低发酵液pH值。WANG等[19]研究发现，硅酸盐细菌R.tropiciQ34能产生有机酸，促进硅酸盐矿物风化，从而释放出钾和硅。这仅能说明分泌有机酸是钾细菌分解硅酸盐矿物的机制之一，解钾机制应该是多种因素综合作用的结果，具体还有待于后期进一步研究。

研究发现，钾细菌能促进植物的生长。胡洲等[20]盆栽试验证明，使用硅酸盐细菌25 d后，玉米苗的根长、株高、叶宽和鲜质量显著增加。本研究对筛选出的钾细菌进行番茄促生试验，结果表明，SK1-7、SK2-3、SK2-7处理能显著或极显著促进番茄种子萌发，且在番茄株高、鲜质量、干质量等方面均有一定的促进作用。生物活性检测发现，5株钾细菌均具有分泌IAA能力；SK2-7和SK3-10发酵液具有抑菌作用；SK1-7具有分泌蛋白酶能力。GOSWAMI等[21]发现，Kocuriaturfanensis2M4在最佳生长条件下，可产生38 μg/mL IAA，能显著增加花生的株高和鲜质量。