田孟祥，宫彦龙，张时龙，雷 月，何友勋，李佳丽，余本勋，张大双，叶永印，闫志强

(1.毕节市农业科学研究所，贵州 毕节 551714； 2.贵州省水稻研究所，贵州 贵阳 550006)

水稻是我国重要的粮食作物之一，其栽种面积约占粮食作物总面积的1/3，产量约占粮食产量的1/2，为中国60%以上的人口提供口粮[1]。水稻的研究工作对我国的粮食生产及安全有着极为重要的意义。随着现代分子生物学的发展，分子技术已成为水稻研究的重要手段，以DNA作为研究对象最为广泛，如基于DNA的基因定位、基因克隆及各种分子标记的开发与应用等。目前，关于水稻DNA提取方法的研究颇多，较早的主要是传统的CTAB法[2]和SDS法[3]。随着专家学者的不断探索，以上2种方法又各自衍生出了一些新的提取方法[4-6]，甚至脱离了传统CTAB及SDS方法的束缚，发展了全新的提取方法，如TE煮沸法[7]、NaOH法[8-11]、TPS法[12-14]、PCR缓冲法[15]等。水稻的DNA提取方法很多，但是，无论哪种提取方法，从操作程序步骤上来看，都可简要地概括为两大部分，一是材料(如叶片、种子等)的制备，二是提取试剂的加入。

叶片是水稻最常用、最易于进行DNA提取的组织，针对叶片的DNA提取方法最为多见。众所周知，叶片研磨得越细，越有利于DNA的浸出，所提取到的DNA量也越多。在提取DNA的叶片制备方面，发展了操作较为快捷的剪切法[16]、钢珠法[17]等，诸多新开发的DNA提取方法大都是建立在这2种叶片制备基础之上，但是，不管研究者对DNA需求量的多寡，传统的CTAB、SDS及其衍生方法最受青睐[18-21]，使用人数最多，可能是由于这些方法提取的DNA质、量兼顾的原因。这些传统及其衍生提取方法，其普遍的1个特征就是水稻叶片需精心制备、磨细，以便后续加入试剂后DNA易于浸出。叶片的磨细制备工艺，目前主要有液氮冷冻后研磨、无须冷冻直接研钵研磨及真空冷冻干燥后研磨等3种。其中，无须冷冻直接研钵研磨操作繁琐，费工费时，效率低下，少有使用；干燥冷冻法仪器昂贵，一些实验室根本不具备使用条件，且其干燥冷冻效果也不太令人满意；液氮冷冻方法综合效果较佳，也较为实用和常用。利用液氮冷冻叶片，可使叶片受冻变脆利于研磨，同时在低温条件下也更利于组织细胞保护。然而，在实际工作中，使用液氮处理叶片，也表现出一些不便：在液氮冷冻叶片之前，需将叶片的附着水擦干，以免叶片冷冻不充分，影响后续研磨效果，无疑这一操作步骤，也制约着工作效率的提高；在常压下，液氮温度为-196 ℃，稍有不慎易被冻伤，且由于温度极低，不宜长时间接触；为操作方便，使用过程基本置于开放环境中，而液氮极易挥发，有效利用率低，在常规条件下也不易储存；样品需浸没在液氮中受冻，使用量大，成本较高，甚至某些地方使用者附近无液氮销售，更是增加了使用困难等。鉴于以上液氮使用存在的一些不足，需要尝试寻找简便实用的替代方法。为此，研究烘干法替代液氮冷冻法研磨水稻叶片提取DNA的可行性，并分析不同烘烤温度烘干水稻叶片研磨提取DNA的扩增效果差异，以期筛选最佳的烘烤温度。该方法简便实用，可较好地替代液氮冷冻法制备叶片，进行DNA大量提取，有着重要的推广价值和实践意义。

1 材料和方法

1.1 供试材料

水稻材料：纳雍五里香、毕粳43。

主要设备、工具：干燥箱、离心管、塑料研磨棒、离心管架等。

1.2 试验方法

1.2.1 水稻叶片制备 取水稻新鲜叶片约0.4 g，放入2 mL的离心管中，然后将该离心管置于干燥箱中进行烘烤，干燥箱温度设置5个处理，即50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃；烘烤时间为24 h，取出离心管，放在离心管架上(固定)，用塑料研磨棒伸入离心管内，上下来回敲击叶片，搅碎叶片成粉状。每个处理设置3个重复。以直接液氮冷冻研磨水稻新鲜叶片为对照。

1.2.2 水稻DNA大量提取 将上述已制备好的水稻叶片粉状物加入1.5 mL CTAB溶液(2%CTAB、1.4 mol/L NaCl、0.2 mol/L EDTA、0.1 mol/L Tris Basic、pH值8.0)，在65 ℃下水浴1 h，期间摇晃数次；12 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL移至2 mL的EP离心管中，弃去沉淀；加入苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液(25∶24∶1)1 mL，摇床水平摇动15 min；12 000 r/min离心10 min，小心吸取上清0.7 mL至2 mL的EP离心管中；加入氯仿∶异戊醇溶液(24∶1)0.7 mL，摇床水平摇动15 min； 12 000 r/min离心10 min，取上清液0.4 mL至已灭菌1.5 mL的EP离心管中，加40 μL的3 mol/L NaAC(pH值5.2)，再加入0.8 mL的-20 ℃的无水乙醇，在-20 ℃静置1 h；在-10 ℃下，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入0.5 mL 75%乙醇洗涤2次；将离心管放置超净工作台中风干，加入0.3 mL超纯水溶解备用。

1.2.3 PCR扩增及电泳检测 采用陆艳婷等[22]报道的香味基因Badh2的四引物标记对本研究所介绍方法提取的DNA质量进行鉴定，四引物序列如下，ESP：5′-TTGTTTGGAGCTTGCTGATG-3′；EAP：5′-AGTGCTTTACAAAGTCCCGC-3′；IFAP：5′-CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC-3′；INSP：5′-CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA-3′。以上四引物在同一PCR管里进行扩增，纯合非香稻可获得长度为585、355 bp的2条带，纯合香稻可获得长度为577、257 bp的2条带。

PCR扩增体系为20 μL，包括DNA 2 μL(10～100 ng/L)、四引物各0.5 μL(2 μmol/L)、10×TaqBuffer 2 μL、Mg2+1.2 μL、dNTP Mixture 0.4 μL(2.5 mmol/L)、TaqDNA聚合酶0.4 μL(2.5 U/μL)、dd H2O 12 μL。以上引物和其他PCR组分试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火复性30 s，72 ℃延伸30 s，循环31次；72 ℃延伸10 min，10 ℃ 2 min。将产物取出备用。

电泳检测：将扩增产物用约2%的琼脂糖凝胶(TBE缓冲液)于120 V电压下电泳30 min，用Gillgreen核酸染料染色；用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的DNA分子质量Marker B(100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp和600 bp)为对照，电泳结束后将凝胶置于凝胶成像系统GEL DOC XR中观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 烘干法和液氮冷冻法的叶片制备效果、效率分析

水稻叶片烘干后变脆，用塑料研磨棒伸入试管里，上下敲击，很容易就把叶片击碎成粉状，简单快速。而用液氮冷冻的叶片，亦可磨成粉状，但需研磨时间稍长，且要在液氮冷冻处理前把附着在叶片上的水擦干，否则叶片冷冻不充分，难以磨细；另外，在叶片被液氮冷冻取出后，应迅速研磨，一旦液氮蒸发完，叶片变软，将导致研磨困难，操作连续紧凑，工作强度大；再者，液氮极冷，稍有不慎易被液氮冻伤，不宜长时间接触。可见，就操作性而言，上述2种不同的水稻叶片制备方法，以烘干法较为简便，效率高，可操作性强。烘干法磨样情况如图1所示。

a.烘干法磨样前工具、材料准备；b.烘干法磨样后情况a.Tool and material preparation before sample grinding by drying method;b.Sample grinded by drying method图1 烘干法磨样情况Fig.1 Sample grinded by drying method

2.2 水稻叶片在50 ℃烘干磨碎与液氮冷冻研磨的DNA提取扩增效果分析

对于水稻来说，叶片是提取DNA的最佳组织。一般用于水稻DNA大量提取的叶片，需要被磨碎、磨细，主要采用的方法有3种，即新鲜叶片于研钵中直接研磨、叶片液氮冷冻后研磨及冷冻干燥机冷冻后研磨，由于直接研磨效率低和冷冻干燥机昂贵等原因，以液氮冷冻后研磨最为普遍。利用液氮冷冻的作用，一方面是让叶片冻脆便于研磨，另一方面则是保护组织细胞减少降解。干燥箱对叶片进行烘烤处理，也可达到叶片变脆利于研磨的效果，操作上更便捷高效，是否也能提取出合格的DNA呢？本研究进行了试验探索，基于能烘干和低温保护组织考虑，设置烘烤温度为较低的50 ℃，同时以液氮冷冻研磨法为对照。

利用以上2种方法研磨叶片组织提取DNA，为了更好地对比扩增效果，本研究使用了对DNA质量要求较高的四引物扩增受阻突变体系PCR技术，使用的水稻材料为纳雍五里香，PCR扩增产物的电泳检测图谱见图2。由图2可知， 50 ℃烘干磨碎与液氮冷冻研磨水稻叶片提取的DNA均能有效扩增出577、 257 bp 2条带，且扩增效果相当，表明50 ℃烘干磨碎与液氮冷冻研磨水稻叶片提取DNA的PCR扩增效果无明显差异，因此,50 ℃下烘干水稻叶片提取DNA方法切实可行。

M：Marker B；1—3：液氮冷冻法提取的DNA；4—6：50 ℃烘干法提取的DNAM：Marker B；1—3：DNA extracted from leaf grinded by liquid nitrogen freezing method; 4—6：DNA extracted from leaf grinded by drying method under 50 ℃图2 50 ℃烘干法和液氮冷冻法研磨叶片提取的DNA扩增效果Fig.2 Amplification effects of DNA extracted from leaf grinded by 50 ℃ drying method and liquid nitrogen freezing method

2.3 不同温度烘烤水稻叶片提取DNA的扩增效果分析

在干燥箱50 ℃环境下烘干水稻叶片提取的DNA，经PCR扩增后发现，其扩增效果与液氮冷冻磨样提取法无明显差异。随着烘烤温度的增加，烘干叶片的时间相对减少，然而，温度提高很可能会影响DNA的提取质量。为探讨较高烘烤温度对DNA提取质量的影响，笔者又设置了60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃ 4个不同温度，并以50 ℃为对照。

由图3可知，60 ℃烘干水稻叶片提取的DNA(毕粳43)和70 ℃烘干水稻叶片提取的DNA(纳雍五里香)均能进行有效扩增，两者扩增效果差异不明显，但条带亮度不及50 ℃烘干水稻叶片提取DNA的效果好，可能是由于温度高导致DNA降解的缘故，而80 ℃和90 ℃烘干水稻叶片提取的DNA未能进行有效扩增。试验结果表明，在温度不高于70 ℃的条件下对水稻叶片进行烘干磨碎提取DNA，可用于常规PCR扩增，以50 ℃最佳。

M：Marker B；1—3：50 ℃烘干法提取的DNA；4—6：60 ℃烘干法提取的DNA；7—9：70 ℃烘干法提取的DNA；10—12：80 ℃烘干法提取的DNA；13—15：90 ℃烘干法提取的DNAM：Marker B；1—3：DNA extracted from leaf grinded by drying method under 50 ℃;4—6：DNA extracted from leaf grinded by drying method under 60 ℃;7—9：DNA extracted from leaf grinded by drying method under 70 ℃;10—12：DNA extracted from leaf grinded by drying method under 80 ℃;13—15：DNA extracted from leaf grinded by drying method under 90 ℃图3 不同温度烘干水稻叶片提取的DNA扩增效果Fig.3 Amplification effects of DNA extracted from drying leaves under different temperatures

3 结论与讨论

自从PCR技术诞生以来，分子标记在基因定位、遗传多样性分析、种质鉴定、转基因检测及分子标记辅助育种等方面得到了广泛应用，而DNA提取是进行以上分子生物学研究的基础和前提条件[23]。提取基因组DNA的质量直接关系到后期分子生物学试验的成败。在水稻中，关于DNA的提取方法颇多，特别是近年来，各种快速提取DNA的方法更是层出不穷。但是，大部分研究还是更加倾向于使用传统的CTAB法、SDS法及其衍生的一些新方法等DNA大量提取法；这些方法满足了质量和数量兼顾需求，可信度无可替代，奉为经典，应用率高。DNA大量提取主要涉及两大部分，一是水稻叶片的制备，二是制备之后加入相关试剂进行DNA提取，不少专家学者对DNA提取方法进行了改进，但主要关注于提取试剂的选择上，对前期的工作即水稻叶片制备环节研究极少。水稻叶片制备也是影响DNA提取效率和成败的关键因素，对于DNA的大量提取，需要对叶片进行研磨，使其粉碎变细。液氮冷冻后研磨是最常用的叶片制备方法，但其在实际应用中也存在费用较高、储存不便等一些不足，特别是无法购置到液氮的实验室，更是无法感受到液氮带来的恩惠，实用性受限，新的替代方法渴求开发。本研究开发了一种可用于DNA大量提取的水稻叶片简便制备方法，其PCR扩增效果与液氮法相当，但可操作性和实用性更强。其主要操作是将叶片放入2 mL的离心管中，于干燥箱内烘干变脆，然后用塑料研磨棒伸入离心管内把叶片捣碎。针对烘干法，从防高温导致叶片DNA降解方面考虑，首先设置为较低温度即50 ℃，试验结果表明，在此温度下所提取的DNA扩增效果与液氮研磨提取法无明显差异；进而又设置了60 ℃、70 ℃、80 ℃及90 ℃等4个不同温度进行烘干试验，从结果来看，60 ℃和70 ℃提取的DNA均能进行有效扩增，且两者扩增效果差异不明显，但均不及50 ℃的效果好，可能是高温导致DNA降解的缘故；80 ℃和90 ℃下提取的DNA没有检测到扩增条带，不宜使用。值得注意的是，本研究烘烤处理时间统一设置为24 h，其实，在以上提及的温度中，烘干时间绰绰有余；温度高，烘干所需时间将减少，较高烘烤温度烘干后及时取出，是否会提高DNA的提取质量，仍需进一步研究。

基于PCR扩增目的进行的DNA大量提取，可利用烘干法替代液氮冷冻法对水稻叶片进行制备，依本试验验证，建议使用烘烤温度为50 ℃；从干燥箱取出，不宜长时间放置以免叶片吸水变软，影响研磨。烘干法所需设备易得，且具有操作简单、费用低廉及实用性强等诸多优点，既可少量操作，亦可批量进行，同时也弥补了液氮冷冻法操作复杂和费用较高等缺点，在DNA大量提取中具有较高的推广应用价值。