周春元，许世泉，闫梅霞，崔丽丽，华 霜，王英平

(中国农业科学院 特产研究所，吉林 长春 130112)

人参(PanaxginsengC.A.Mey)为五加科人参属多年生草本植物，主要分布在我国东北地区，其中吉林省长白山麓是人参的主产区。近年来，随着人参产业的迅速发展，人参病害逐年加重。人参黑斑病(Alternariapanax)是人参生产中发生较普遍、无害较严重的病害之一，其发病率为20%～30%，严重的可达70%以上甚至绝收[1]。该病害主要危害叶片、茎和果实，造成人参叶片早期落叶，植株提前枯萎，不结实及参根减产等[2]。目前，生产上人参黑斑病防控以化学防治为主，通过施用嘧菌酯等化学药剂控制病情蔓延[3]，但化学防治容易导致农药残留、病原菌产生耐药性，并对环境造成一定的污染[4]。生物防治可以抑制人参病害的发生，且具有绿色、安全、高效等特点，是目前较为理想的病害防治方法，但利用此法进行人参黑斑病防治的报道较少。因此，寻找能够有效防治人参黑斑病的微生物菌种资源显得尤为重要。

植物内生真菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段，生活于健康植物各种组织内，不会引起宿主植物发生明显病害的一类微生物类群[5]。内生真菌产生的次生代谢产物可防治植物病害[6]、促进植物生长[7]、提高植物抵抗病原菌的能力[8]等，近年来，有关内生真菌的研究逐渐受到关注。因此，以健康林下参叶片内生真菌为研究对象，将对人参黑斑病菌具有良好拮抗作用的内生菌株进行鉴定，并优化培养基配方和发酵条件，以期为利用林下参内生真菌进行人参黑斑病的生物防治奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试林下参叶片 2018年7月，于吉林省抚松县林下参种植地，根据5点取样法，采集15年生健康植株的叶片，装入自封袋带回实验室，4 ℃保存备用。

1.1.2 供试病原菌 人参黑斑病菌(Alternariapanax)、人参锈腐病菌(Cylindrocarpondestructans)、人参立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、人参根腐病菌(Fusariumsolani)、人参灰霉病菌(Botrytiscinerea)、人参菌核病菌(Sclerotiniaschinseng)、人参疫病菌(Phytophthoracactorum)均由吉林农业大学植物病理实验室提供。

1.1.3 培养基 基础发酵PD培养基：葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化钠 5.0 g、碳酸钙1.0 g，调节pH值7.0，蒸馏水定容至1 L[9]。

1.2 林下参内生真菌的分离纯化

采用组织分离培养法[10]分离林下参叶片内生真菌。将采集的健康林下参叶片用自来水冲洗，除去表面的泥土，置于无菌操作台上，进行表面消毒处理。无菌水换洗3次，75%乙醇浸2 min。无菌水换洗3次，0.1 %升汞浸1.5 min。无菌水换洗3次，用无菌刀片将叶片剪成长0.5 cm×0.5 cm小方块，用无菌镊子将叶片移至PDA平板上，每个培养皿放置5块，于25 ℃恒温培养箱中培养，逐日观察。待长出真菌菌丝时，挑取菌落边缘菌丝接入新的PDA培养基上，进行纯化培养。吸取5 mL最后一次换洗的无菌水，涂在PDA培养基上，验证消毒是否彻底。

1.3 皿内拮抗抑菌试验

采用平板对峙法筛选内生拮抗真菌。将活化的林下参内生真菌和人参病原菌用5 mm无菌打孔器打成菌饼，用灭菌针将内生真菌和人参病原菌接种到同一PDA平板上，2种菌相距3 cm，以只接种人参病原菌的PDA平板为对照。每个处理3个重复，于25 ℃恒温培养箱中培养，7 d后采用十字交叉法测量人参病原菌菌落直径，计算林下参内生真菌对人参病原菌的抑菌率[11]。

抑菌率=(对照人参病原菌菌落直径-对峙培养人参病原菌菌落直径)/对照人参病原菌菌落直径×100%。

1.4 菌株发酵液抑菌试验

1.4.1 发酵液的制备 前期初筛到1株内生真菌，命名为FS-01。将该菌株在PDA平板上活化7 d后，在无菌的条件下，用5 mm打孔器打取10个菌饼，转接到装有100 mL PD液体培养基的250 mL锥形瓶中，于黑暗条件下25 ℃、120 r/min转速恒温摇床上振荡培养7 d。无菌条件下，将培养的菌液经灭菌的双层纱布过滤除去菌丝，滤液经5 000 r/min离心15 min去除沉淀，上清液经孔径为0.22 μm的细菌过滤器过滤得到FS-01菌株无菌发酵液，置于冰箱(4 ℃) 中保存备用[12]。

1.4.2 发酵液对人参病原菌菌丝生长的抑制作用 吸取2 mL制备好的发酵液，加至45 ℃的PDA培养基中，混匀。以加入2 mL无菌水的平板作对照，将人参病原菌菌饼接种于平板中央，置于25 ℃恒温培养箱中培养。培养7 d后采用十字交叉法测量菌落生长直径，计算FS-01菌株对人参病原菌的抑菌率，方法同1.3。

1.5 内生拮抗菌的鉴定

1.5.1 形态学鉴定 将林下参内生真菌接种于PDA平板上，采用插玻片法将无菌盖玻片以45°角插入培养基中，置于25 ℃恒温培养箱中培养7 d后，在显微镜下观察病原菌形态特征。

1.5.2 分子生物学鉴定 利用DNA试剂盒提取林下参内生真菌基因组，对rDNA-ITS区域进行PCR扩增，真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系(25 μL)：10×PCR缓冲液2.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，5 U/μL的Taq酶0.1 μL，DNA模板为1.0 μL，最后加双蒸水补足至25 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性40 s，53 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

PCR产物纯化和测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。利用BLAST软件将测序结果在NCBI数据库中进行查找，应用Clustal软件进行ITS序列比对，最后用MEGA 7.0软件以邻接法构建系统发育树。

1.6 拮抗菌株抑菌图谱的测定

采用平板对峙法对拮抗菌株进行抑菌图谱的测定，方法参考1.3。

1.7 拮抗菌株发酵条件优化

1.7.1 培养基成分优化 碳源优化：在其他条件不变的情况下，分别用麦芽糖、乳糖、玉米粉、淀粉和蔗糖等量替换基础发酵培养基中的葡萄糖，以基础发酵培养基为对照。

氮源优化：在其他条件不变的情况下，分别用酵母浸粉、牛肉膏、硝酸钾、尿素、氯化铵等量替换基础发酵培养基中的蛋白胨，以基础发酵培养基为对照。

无机盐优化：在其他条件不变的情况下，分别用磷酸氢二钾、硫酸锰、硫酸镁、硫酸锌和硫酸亚铁等量替换基础发酵培养基中的碳酸钙，以基础发酵培养基为对照。

1.7.2 培养基成分正交试验 根据培养基成分单因素试验的结果，选择最佳碳源(淀粉)、氮源(酵母浸粉)、无机盐(磷酸氢二钾和硫酸镁)共4个因素，设置3个水平，进行正交试验(表1)。发酵试验设计3次重复，取3次试验的平均值作为发酵配方的试验结果。

表1 培养基成分正交试验因素与水平Tab.1 Orthogonal factors and levels of culture medium %

1.7.3 发酵条件优化 基于优化的发酵培养基，检测起始pH值、温度、接种量和发酵时间对菌株FS-01抑菌效果的影响。(1)起始pH值：设置5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0共6个起始pH值，接种后于25 ℃、150 r/min条件下培养5 d，检测抑菌效果；(2)温度：设置20、25、30、35、40、45 ℃共6个温度，接种后于150 r/min条件下培养5 d，检测抑菌效果；(3)接种量：设置3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%共6个接种量，接种后于150 r/min条件下培养5 d，检测抑菌效果；(4)发酵时间：设置2、3、4、5、6、7 d共6个发酵时间，接种后于25 ℃、150 r/min条件下培养，检测抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 林下参内生拮抗菌的分离筛选

从表2可以看出，菌株FS-01与人参病原菌对峙培养7 d时，对供试的7株病原菌均有不同程度的抑制作用，其中对人参黑斑病菌抑制效果最好，抑菌率为35.83%；从表3可以看出，菌株FS-01的发酵液对7株病原菌也表现出较好的抑菌效果，在对峙培养第7天时，菌株FS-01的发酵液对人参黑斑病菌的抑菌效果最好，为49.04%。

表2 菌株FS-01对人参病原菌菌丝生长的抑制作用Tab.2 Inhibitory effect of FS-01 strain against mycelial growth of ginseng pathogens %

2.2 拮抗菌株的鉴定

2.2.1 形态学鉴定 将筛选获得的拮抗菌株FS-01接种至PDA培养基中， 培养5 d后， 菌落呈淡黄色、边缘不规则形(图1A)。培养10 d左右，有子囊果长出，子囊果椭圆形，子囊孢子褐色、柠檬形，两端突起，顶端具有萌发孔(图1B)。

表3 菌株FS-01发酵液对人参病原菌菌丝生长的抑制作用Tab.3 Inhibitory effect of FS-01 strain fermentation broth against mycelial growth of ginseng pathogens %

2.2.2 分子生物学鉴定 菌株FS-01的18S rDNA测序得到了571 bp DNA序列，将得到的序列与NCBI数据库BLAST比对，结果显示，FS-01菌株与登录号为 KX421415.1的球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)亲缘关系最近，处于系统发育树的同一分支上(图2)。结合菌株FS-01在PDA平板上的形态学特征，以及基于18S rDNA序列的系统发育分析结果，鉴定菌株FS-01为球毛壳菌(C.globosum)，命名为C.globosumFS-01。

图1 FS-01菌株形态学特征Fig.1 Characteristics of FS-01 strain on PDA

图2 FS-01菌株基于18S rDNA的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of FS-01 strain based on 18S rDNA sequences

2.3 拮抗菌株抑菌谱的测定

平板对峙法结果表明，FS-01菌株对多种人参病原菌具有较强的抑制作用，其中，对人参黑斑病菌抑制效果最佳，抑菌率高达83.12%(表4)，可见菌株FS-01抑菌谱较广，可开发为人参黑斑病的生防菌株。

2.4 拮抗菌株发酵条件优化

2.4.1 培养基成分优化 不同碳、氮源和无机盐对FS-01菌株抑菌活性的影响如表5所示。在所有碳源中，以淀粉为碳源时抑菌圈最大，抑菌圈直径为20.37 mm，因此淀粉为最适碳源；在所有氮源中，以酵母浸粉为氮源时抑菌圈最大，抑菌圈直径为23.15 mm，因此酵母浸粉为最适氮源；在所有无机盐中，以磷酸氢二钾为无机盐时抑菌圈最大，抑菌圈直径为23.85 mm，因此磷酸氢二钾为最适无机盐。

表5 不同碳、氮和无机盐对菌株FS-01抑制作用的影响 Tab.5 Effect of different carbon sources,nitrogen sources and inorganic salts on inhibitory effect of FS-01 strain mm

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences(P<0.05).

2.4.2 正交试验 以淀粉(A)、酵母浸粉(B)、磷酸氢二钾(C)和硫酸镁(D)为因素，按L9(34)正交表设计四因素三水平的正交试验，通过测定FS-01菌株对人参黑斑病菌的抑菌活性大小，确定最佳发酵培养基配方。正交试验的极差分析表明，4 个因素对人参黑斑病抑菌率的影响为A>B>D>C，最佳水平组合是A2B2C1D2(表6)；方差分析结果表明，因素A对FS-01菌株发酵液抑菌活性影响显著，因此确定培养基的最佳配方：淀粉1.50%、酵母浸粉1.00%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸镁0.10%。

表6 发酵培养基正交设计L9(34)及试验结果Tab.6 L9(34) orthogonal design of fermentation culture medium and the test results

2.4.3 发酵条件优化 在已经确定的最佳培养基成分基础上，对FS-01菌株的发酵条件进行单因素优化试验(图3)。结果表明，不同培养条件对FS-01菌株的抑菌活性影响较大，当pH值为7时，抑菌率最大为28.54%，pH值过高或过低，都会降低FS-01菌株的抑菌活性；当培养温度为30 ℃时，抑菌率最大为45.24%，FS-01菌株的抑菌活性最强；当接种量为6.0%时，抑菌率最大为54.13%；抑菌率随发酵时间的延长先升高后降低，当发酵时间为5 d时抑菌率最大为63.18%。由此可知，拮抗菌株FS-01最适发酵条件：pH值为7.0，最适培养温度为30 ℃，最适接种量为6.0%，最适培养时间为5 d。

在最佳培养基成分和发酵条件下，进行3次验证试验，抑菌率为92.65%。因此，优化后的发酵培养基成分和发酵条件有利于FS-01菌株抑菌活性物质的生成。

图3 不同发酵条件对FS-01菌株发酵液抑菌活性的影响Fig.3 Effect of different fermentation conditions on the inhibition activity of FS-01 strain

3 结论与讨论

本研究从健康林下参叶片中筛选出1 株内生拮抗真菌FS-01菌株，经鉴定为球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)，在最佳培养基成分和发酵条件下，该内生拮抗真菌对人参黑斑病的抑菌率为92.65%。

球毛壳菌隶属于子囊菌亚门、毛壳菌科、毛壳属真菌，广泛分布于空气、土壤等多种自然环境中，也是常见的植物内生真菌。该属能产生生物活性的次级代谢产物[13]，如球毛壳素类、鞘氨醇、嗜氮酮类等，具有促生、抑菌、抗病毒等生物活性[14]。球毛壳菌是毛壳属中的重要菌群，存在于各种植物体内，对植物病害起潜在的生防作用。兰楠等[15]从油菜幼苗中分离出的球毛壳菌对4种油菜病原菌有不同程度的抑制作用；岳会敏等[16]发现，球毛壳菌对5种植物病原菌有明显的抑制作用，主要是通过竞争作用、重寄生作用抑制病原菌生长；印容等[17]研究表明，内生真菌球毛壳菌产生的鞘氨醇次生代谢产物对油菜根肿病具有很好的生防作用。本研究从健康林下参叶片中分离获得的球毛壳菌FS-01菌株，对7种人参病原菌有抑制作用，尤其对人参黑斑病菌抑制效果最强，因此，该内生真菌可作为人参病害的生防菌。

抑菌活性物质受外界培养条件的影响，为了提高FS-01菌株抑菌活性物质的产量，通过单因素试验优化了培养基成分及发酵条件，后续将探究其抑菌机制，以期为将其大规模开发成一种新型生防菌剂奠定理论基础。