白头翁与艾叶提取物对大肠杆菌的抑菌效果

2020-02-24龚团莲

中国畜禽种业 2020年1期

龚团莲

（内蒙古民族大学动物科学技术学院 028042）

兽用药物种类和应用规模越来越广，化学结构和成分日益变复杂、多样化。并且追求高效、快速、低剂量化。人们对长期摄入低水平、劣质药物残留所导致的各种慢性及远期效应进行全面关注[1]。

在畜牧业中，抗生素被广泛作为药物添加剂用于畜禽防治微生物感染和抑制细菌生长，但其在动物性食品中的残留对消费者健康存在潜在威胁。动物性食品从古至今都是人类能量的来源，如果其中含有抗生素，对消费者来说等于服用小剂量抗生素，抗生素残留可把人体致病菌和有益菌同时消灭，也可导致体内某些致病菌产生耐药性，一旦患病者再次用同种抗生素治疗很难见到疗效，从而降低人们对病菌的免疫能力。结果表明，细菌耐药性与细菌耐药基因有密切相关，细菌耐药基因主要位于细菌染色体和质粒上。耐药质粒可通过接合、转化、转导等方式转移，使耐药菌株增加，因此，消除耐药质粒对控制细菌耐药性的传播有重要意义[2]。本文主要介绍中草药白头翁和艾叶的有效成分提取物对大肠杆菌抑菌作用的研究。有研究表明，白头翁和艾叶对大肠杆菌均有一定抑菌效果，中草药属于纯天然药物，具有抗菌，抗毒素，提高免疫系统调节功能，具有无污染、副作用小、残留毒素少，不容易产生耐药性等优点，在中药医学中发挥了预防和抑制细菌性感染疾病的重要作用[3]。同时从天然中草药中筛选抗菌药物用于防治疾病已成为解决抗生素滥用问题的有效途径之一[4]。

1 白头翁与艾叶的概述

1.1 白头翁简介

中药白头翁为毛茛科植物，银莲花属多年生草本植物。别名有老翁花、奈何草、老姑草等。具有清热解毒、凉血止痢、除湿杀虫的作用[5]。白头翁有效成分有三萜皂苷、木脂素、三萜酸、白头翁灵、白头翁素、白头翁英、原白头翁素、胡萝卜苷及糖蛋白等成分[6]。

据报道，近几年对白头翁传统抗菌、抗病毒、抗病原虫的作用较为深入研究。白头翁提取物对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、热带假丝酵母[7]白色葡萄球菌、炭疽杆菌、乙型链球菌等均有明显抑菌作用[8]。同时也可抗病原微生物、寄生虫、治疗内毒素血症、护肝、杀精、短时间内可杀死阴道滴虫。白头翁素具有镇静、镇痛及抗痉挛等作用[9]。

白头翁除了抗菌抑菌和抗原虫作用外还具有抗癌、抗肿瘤、增强免疫功能、抗炎等作用[10]。同时对消化系统、心血管系统、泌尿系统、造血系统及妇科等多种疾病均有治疗作用。但白头翁新鲜时有毒，如误食易引起胃肠炎和便血；可作土农药常用来杀虫蛹。

1.2 艾叶简介

艾叶属于菊科类植物，具有浓烈清香味。艾叶辛、苦、温、归肝脾肾经、有散寒止痛、少腹刺痛、温经通络、暖宫调经、安胎的作用，为 “止血良药” 也是中医妇科常选的草药[11]。在众多期刊上了解到艾叶的有效化学成分主要有挥发油，黄酮类、其次有三萜类、鞣质类、桉叶烷类、多糖类及微量元素等[12]。艾叶所含的组分繁多而复杂，其主要成分含量与组分含量随产地、品种类别、栽培环境、采收时间等不同有所差异。

现代药理研究中表明，艾叶提取液具有抗病毒、抗菌、镇咳、祛痰、平喘、消炎、抗过敏、护肝利胆、促进消化、镇静等诸多药理作用[13]。对多种细菌病毒有抑制作用，如白喉杆菌、结核杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等[14]。临床上主要用于经寒不调、安胎、杀虫止痒此外，还常用于皮肤科疾病，消化系统疾病、肿瘤、疟疾、痹痛、小儿阴缩症[15]。同时也可对口腔支原体病原、肺炎支原体病原多较为显著抑制作用[16]。艾叶资源丰富、廉价、低毒，是一种广谱的抗菌抗病毒的草药。

2 实验材料与仪器

2.1 材料

白头翁饮片、艾叶饮片（华天制药有限公司供应）。

2.2 菌株来源

菌株来源：内蒙古民族大学（微生物实验室）。

菌株种类：三元猪场分离的大肠杆菌杆、肝脏大肠杆菌（第1 次提取）、肝脏大肠杆菌（第2 次提取）、肝脏大肠杆菌（第3 次提取）、肝脏大肠杆菌（第4 次提取）蒙鹅鹅业大肠杆菌、猪大肠杆菌杆、大鸟鹅业大肠杆菌杆G3、标准大肠杆菌。

2.3 仪器

分析天平（塞多利斯科学仪器有限公司），旋转蒸发器RE-529991282 (上海亚荣生化仪器)，循环水真空泵SHZ-Ⅲ（上海亚荣生化仪器厂），旋转蒸发器RE-529991282 (上海亚荣生化仪器)，pH 计（PHS-3C）上海仪电科学仪器股份有限公司，电子天平称TD1000LC (天津天马街基仪器有限公司)，XMTD-701S42-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂），DF-101S 集热式磁加热搅拌器XMTD-70 （金坛市瑞仪华仪器有限公司），清洗超声仪SK1200H (上海科导超声仪器有限公司)，打孔器 B2914、滤纸 (新华一号)、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养皿、试管、青霉素小瓶、重量瓶、涂布器、镊子、接种环、移液枪、枪头、移液管、酒精灯、酒精棉球、记号笔、冷凝管。

2.4 试剂

蛋白胨、琼脂粉、牛肉浸膏、氯化钠均为分析纯；氢氧化钠、硫酸、氯化钡、乙醇。

2.5 原料药物

硫氰酸红霉素、硫酸安普霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、盐酸环丙沙星、替米考星、磺胺喹噁啉钠、乳酸诺氟沙星、硫酸新霉素、磺胺氯丙嗪钠（以上药物均为医疗级原粉）。

3 白头翁、艾叶有效成分的提取

3.1 中药有效成分提取概述

中草药随不同成分而有不同程度的溶解性和分子极性，水煎剂为最古老的服用方法之一。目前研究表明，大多中草药抑菌中使用的是水提取法，以水作为溶剂提取有效成分，这可能会导致某些非水溶性有效成分的损失，除了水以外还有亲水性有机溶剂及亲脂性有机溶剂，如氯仿、乙醚、乙醇、丙酮等。另外，提取法有热回流、蒸馏、渗渡法、超声法等，在提取过程中时间、温度、提取法等都会影响有效成分的提取，从而导致其抑菌效果[17]，提取工艺涉及提取、分离、浓缩、纯化精制、干燥等过程[18]。在白头翁和艾叶提取工艺中，白头翁提取参考宋科标、时维静[19]等采取热回流提取法和超声法，其中选择水和70%的乙醇作为溶剂，水提取作为对照，70%的乙醇提取率最为高，所以用70%的乙醇在不同时间内提取，超声时间不要过长，筛选最佳提取率，而艾叶提取工艺中参考冯丽娟、孙志勇等[20]报道，用艾叶3 种不同有效成分提取法作为实验方案，方法有水煎、有机溶剂，超声法等对艾叶提取法进行正交实验表的设计，筛选艾叶最佳抑菌效果工艺，不同提取法可有效证明白头翁和艾叶提取液对不同来源大肠杆菌的抑菌效果，在实验中进一步探索和比较不同提取法及时间、温度等问题，以最佳提取工艺发挥中草药的抑菌作用。

3.2 白头翁与艾叶的提取

3.2.1 白头翁的提取工艺

（1）超声法：精确称取白头翁粉，分别加入水和乙醇，超声 20min 和 30min，过滤，减压浓缩至药液含量为 1g/ml，灌入安瓿冷藏备用，参见表1。

（2）回流法：精确称取白头翁粉分别加入水和乙醇，加热回流 60min 和 90min，提取两次，趁热过滤，合并滤液，减压浓缩至药液含量为1g/ml，灌入安瓿冷藏备用，参见表1。

3.2.2 艾叶提取液的制备

（1）水煎煮法：分别精确称取艾叶粉25g，加入不同倍量的水，在不同时间内水煎煮提取并抽虑，减压浓缩至药液含量为1g/ml 灌入安瓿冷藏备用。

（2）有机溶剂法：分别精确称取艾叶粉25g，加入水和不同体积浓度的乙醇、在不同时间内提取，抽滤浓缩至药液含量为1g/ml 备用。

（3）超声法：分别精确称取艾叶粉25g，加入水和不同体积浓度的乙醇进行不同时间的超声波提取，抽滤浓缩至药液含量为1g/ml 备用。

表1 白头翁提取工艺流程

艾叶采取正交实验进行提取，以提取时间、提取方法、料液比例、溶媒为主要因素，采取L9 （34）正交实验设计表，对艾叶的有效成分的最佳提取工艺进行研究，参见表2、表3。

表2 实验因素水平表

表3 正交设计实验安排表

3.2.3 中药提取物的浸膏得率

白头翁提取工艺中最佳水回流60min 提取浸膏率为31%，艾叶第九组实验提取率最佳为27.6%。

4 耐药菌株筛选

4.1 药敏片制备

（1）选新华1 号定型滤纸，用打孔器打成直径为6mm 的小圆片1000 片，将100 个作为一组。

（2）将10 个安瓿清洗干净，放入烘干箱设50℃烘干。

（3）把1000 个圆滤纸片分装到10 个小瓶中，并将小瓶的瓶口用棉塞住，在121℃条件下高压蒸汽锅灭菌30min，置37℃恒温烘干备用。

（4）把烘干好的圆纸片放入重量瓶中，每瓶100 个纸片。

4.2 药液配置

按抗生素药物使用说明书浓度规格换算成一个基本单位药量，用基本单位药量精确称取配料，换算按1g 需加水量，相当于配制药液所加蒸馏水毫升数。硫酸安普5g 可拌25kg 饲料，其换算方法为0.5g 本品加2500ml 蒸馏水，其他抗生素硫氰酸红霉素原料药15mg、硫酸安普霉素10mg、恩诺沙星20mg、氟苯尼考10mg、盐酸环丙沙星20mg、替米考星10mg、磺胺喹恶啉钠30mg、乳酸诺氟沙星20mg、硫酸新霉素10mg、磺胺氯丙嗪钠10mg 倒入10ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至10ml，使其完全溶解。从容量瓶中用移液枪将药液抽取1ml，倒入装滤纸片容量瓶中，浸泡0.5h 后放入恒温烘干箱内烘干30min。用无菌镊子取出滤纸装入安瓿冷冻-20℃保存[21]。

4.3 制备培养基

（1）取 20 个培养皿，10 个试管清洗干净，晾干。用报纸包好培养皿，在121℃下高压蒸汽灭菌锅灭菌30min。

（2）琼脂培养基：称取蛋白胨 10g 牛肉粉 3g 氯化钠 5g 加入1000ml 纯化水，使其完全溶解。用 NaOH 将其pH 调到 7.2～7.6。再加入23g 琼脂，搅半均匀。并放在万用电炉上加热使其完全溶解。然后分别装到两个500ml 的三角瓶中。用棉塞塞住。放在121℃条件下高压蒸汽灭菌锅内灭菌30min 备用。

（3）将配好的固体培养基倾倒在灭菌好的培养皿内。将底部覆盖住并小于4mm。倾倒后待其凝固，凝固后培养皿倒置。

（4）同时把配置好的固体培养基倒入试管内2/3 处，倾斜制成斜面培养基凝固，备用。

（5）液体培养基的制备称取蛋白胨 10g、牛肉粉 3g、氯化钠5g 加入1000ml 纯化水，使其完全溶解。用NaOH 将其pH调到7.2～7.6。然后分别装到2 个500ml 的三角瓶中。用棉塞塞住。放在121℃的条件下高压蒸汽灭菌锅内灭菌30min。备用。

4.4 供试菌悬液的制备

4.4.1 接种

取供试的9 种大肠杆菌菌液接种到以配置好的斜面培养基上，在培养箱 37℃内培养 16～18h，备用。

4.4.2 菌液稀释

麦氏比浊法是McFarland 发明的用于细菌比浊的不同浊度的标准浊度管。配制方法是根据氯化钡和硫酸的比例来决定的，见表4，不同比例生成的硫酸钡沉淀的浓度有明显不同，并且都有一定值。

操作方法：

（1）轻摇标准试管。

（2）测定试管加入无菌生理盐水，直到浓度与所要求的标准管浓度相似。

4.5 贴药敏片

（1）将已稀释好供试的三元猪场分离大肠杆菌、肝脏大肠杆菌（第1 次提取）、肝脏大肠杆菌（第2 次提取）、肝脏大肠杆菌（第3 次提取）、肝脏大肠杆菌（第4 次提取）、蒙鹅鹅业分离大肠杆菌、猪大肠杆菌、大鸟鹅业分离大肠杆菌、标准大肠杆菌等9 种大肠杆菌分别用移液抢抽100ul 菌液，接种到以配好的平板培养基中，用涂菌环将菌液涂均匀。然后将已制备好的药敏片分别贴到已接种的培养基中，轻轻按压，稍等片刻，并倒置培养基，同时在培养皿上用记号笔记录菌液名称、药敏片名称、涂菌日期。置恒温箱培养16～18h。

（2）筛选耐药菌株结果为肝脏大肠杆菌（第1 次提取）、肝脏大肠杆菌（第2 次提取）、肝脏大肠杆菌（第3 次提取）、肝脏大肠杆菌（第4 次提取）、蒙鹅鹅业分离大肠杆菌、猪大肠杆菌、标准大肠杆菌等菌株对几类抗菌药物较为敏感有抑菌圈，而三元猪场大肠杆菌，大鸟鹅业大肠杆菌具有一定程度的耐药性，见表 5，表中（+）表示敏感、（-）表示不敏感.

5 中药提取物的抑菌效果

选择白头翁提取工艺中水回流60min 提取浸膏率最佳31%，艾叶提取中第九组实验提取率最佳为27.6%，条件为50%乙醇16 倍稀释超声提取。

表4 麦氏比浊管的配比

表5 抗菌药抑菌效果表

5.1 测试白头翁与艾叶提取液对标准大肠杆菌株的抑菌效果

以标准大肠杆菌为对照，对三元猪场大肠杆菌和大鸟鹅业大肠杆菌进行中药抑菌实验。

将已制备好的平板培养基分成4 个区域标号分别为：空白、25ul、50ul、100ul，用移液枪抽取已稀释好的菌液 100ul，均匀涂在培养基上，然后选取最佳制备工艺的白头翁和艾叶提取液各一个在菌液上涂药液，用移液枪分别抽25ul、50ul、100ul 药液涂均匀，置培养箱37℃内培养16～18h。

结果表明，空白和白头翁涂25ul 药液部分有明显长菌，而50ul 和100ul 没长菌，具有一定的抑菌效果。艾叶提取液25ul、50ul 没有抑菌效果，而100ul 药液有较小的抑菌效果。

5.2 白头翁和艾叶的最小抑菌浓度的测定

5.2.1 选取提取液

从白头翁和艾叶中选取乙醇提取和水提取浓度最高的2 个药液，以标准大肠杆菌和耐药菌株作为实验研究对象，进行药敏实验。

5.2.2 菌液稀释

取菌液稀释至108 倍，取2ml 加入肉汤稀释至200ml 备用。

5.2.3 稀释抗菌药物的制备及菌液接种

取无菌试管7 支，排放成一排，第一管加8ml 肉汤外其余的6 个管加5ml 肉汤，在第一管加入抗菌药原液2ml，用移液枪吸出混匀，然后吸取5ml 至第2 管，混匀稀释再吸取5ml 至第3 管，如此连续倍比稀释至第6 管，并从第6 管中吸取5ml弃去，第7 管为不含药物的生长对照。然后在每管内加入上述制备好的标准大杆稀释菌液各1ml，第1～5 管药物浓度分别为0.3、0.15、0.075、0.375、0.01875、0.009375/mg，将接种好的稀释管塞好塞子，置37℃保温箱内16～18h[22]。

5.2.4 结果判断与解释

白头翁乙醇回流提取的第1、2 试管没有长菌，第3 个试管有较少细菌，剩下几个试管都都有细菌生长。所以最小抑菌浓度为0.5ml/mg，从艾叶正交实验里挑选提取法最佳的，结果表明最小抑菌浓度为0.3ml/mg。

5.3 白头翁、艾叶提取物对耐药菌株抑菌效果

将稀释好的三元猪大肠杆菌、大鸟鹅液大肠杆菌、标准杆菌分别抽取100ul 涂布于制备好的琼脂培养基上，每个菌液涂6 个平板，在培养基上打距离相等的4 个孔，每孔直径为6mm，孔间距约20mm，每平板上注入3 种不同提取法的药液100ul，加于琼脂孔内，并在另一个孔内加入蒸馏水作为空白对照，置培养箱内培养16～18h，观察结果。

结果判定，如表6、7，白头翁对3 种菌株有明显的抑菌作用，而艾叶抑菌作用不明显。

6 结果

在中药提取实验中，白头翁采用水回流方法提取60min 提取浸膏得率为31%，该条件为最佳提取工艺；艾叶提取的率最佳为第九组27.6%，条件为50%乙醇16 倍稀释超声提取。通过对9 株不同来源的大肠杆菌进行药敏实验筛选耐药性菌株，结果为三元猪场分离的大肠杆菌和大鸟鹅业分离的大肠杆菌具有较强的耐药性，对筛选好的耐药性菌和对照标准大肠杆菌同时进行白头翁、艾叶提取物抑菌实验。结果表明，白头翁提取液对3 种菌株均有一定的抑菌效果，而艾叶对3 种菌株有不同程度的抑菌效果，其效果不明显，抑菌圈儿小。研究表明，白头翁有效成分白头翁素具有一定的抑菌作用，抑菌效果明显。而艾叶中有效成分对大肠杆菌无明显，抑菌效果。但在本实验中，中药提取中存在抑菌效果不稳定性、抑菌机理不清楚等问题，因此，要使中药真正能做到高效抑菌可能还需进一步研究中药抗菌机理。