杜娟娟 董仙兰 赵国洪 李朝 李红霞*

（1，云南农业大学动物医学学院 650201； 2，玉溪农业职业技术学院 653106）

刚地弓形虫 （Toxoplasma Gondii） 是一种在全球分布广且危害较大的人畜共患专性细胞内寄生原虫[1]。 其宿主范围极广，除人之外还包括鸽子及其他温血动物[2]。 鸽子感染弓形虫常呈亚临床症状或无临床症状[3]，有相关研究表明，从鸽体内分离得到的弓形虫可以感染其他动物，说明鸽子也是弓形虫重要的传播宿主[4，5]。 弓形虫感染不仅会对养殖业造成重大经济损失，同时对人体健康也构成严重威胁[6]。 据报道，我国平均弓形虫阳性率为7.88%[7]，鸽子作为食用动物，弓形虫感染对人类安全的威胁不容忽视。

玉溪地区是云南重要的鸽子养殖产地，目前还未见有关云南地区鸽子弓形虫感染情况的相关报道。 弓形虫的感染率可以间接反映人们居住环境中 （土壤、水） 弓形虫卵囊的含量[8]，因此，对该地鸽子进行弓形虫检测具有十分重要的公共卫生学意义。

本文运用IHA 和巢式PCR 两种检测方法对该地鸽子进行弓形虫检测，能准确掌握鸽子弓形虫的感染情况，为鸽子弓形虫病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源和采集

采集云南玉溪地区的鸽子血样共计100 份。 3000r/min 离心10min，吸取血清置于-20℃冰箱备检。

1.2 主要试剂

弓形虫抗体间接血凝 (IHA) 检测试剂盒 (中国农业科学院兰州兽医研究所)，血液DNA 提取试剂盒 （天根公司），PCR 试剂 （大连宝生物公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 血清检测法

参照弓形虫抗体间接血凝 (IHA) 检测试剂盒的说明书，结果判定，阳性对照血清的血清效价高于或等于1:1024，另外，阴性血清对照和稀释液对照各孔均为 “-” （阴性血清对照第1孔可以有前滞现象，其余孔不可以有） 的前提下，判定待检血清效价高于或等于1:64 的为阳性，阳性终点 “++”。

1.3.2 巢式PCR 方法检测

（1） 扩增弓形虫的 SAG3 基因

根据Grigg 等[9]发表的弓形虫SAG3 基因特异巢式PCR 引物对所有样品进行检测。 外引物序列： P43S1:5'-CAACTCTCACCATTCCACCC-3'，P43AS1:5'-GCGCGTTGTTAGACAAGACA-3'； 内引物序列： P43S2:5'-TCTTGTCGGGTGTTCACTCA-3'，P43AS2:5'-CACAAGGAGACCGAGAAGGA-3'。 目的片段大小为225bp。

（2） DNA 提取与巢式 PCR 检测

参照血液DNA 提取试剂盒的使用说明书提取DNA，以提取的DNA 为模板进行巢式PCR 扩增。 第一轮反应总体积为25μL，其中 10×buffer2.5μL，dNTP 2μL，MgCl22μL，引物各0.15μL，模板 1.5μL，Taq 酶 0.2μL，于 94℃预变性 5min 后进入循环，94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 30s，30 个循环后 72℃延伸5min。 第二轮反应体系同第一轮，于94℃预变性5min 后进入循环，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，35 个循环后 72℃延伸5min，同时设立阴阳性对照。

取4μL PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳约20min 后于紫外透射仪中观察，并记录结果。

2 结果与分析

2.1 IHA检测结果

207 份血清样品中检出13 份阳性血清，包括成年鸽血清阳性1 份，幼年鸽血清阳性12 份，总阳性率为6.28%，成年鸽和幼年鸽的血清阳性率之间无显著差异 （ =0.470＞0.05）。 见表1。

表1 不同年龄的鸽子弓形虫感染的血清阳性率

2.2 巢式PCR检测结果

用巢式PCR 检测了对应13 份血清阳性样品的血液DNA，检出1 份阳性，阳性率为7.69%。 将PCR 产物送至测序公司进行测序，将测序的拼接结果在Blast 上比对分析，样本的序列与GenBank 上公布的刚地弓形虫 （T.gondii） 相似性为100%。该对比结果表明，该幼年鸽感染的是刚地弓形虫。 巢式PCR 产物电泳结果见附图。

2.3 巢式PCR与IHA检测结果

IHA 检测的血清阳性率为6.26%，巢式PCR 检测的阳性率为7.69%，见表 2。

表2 不同检测方法的阳性率比较

3 讨论

鸟类感染弓形虫的途径主要是吞食环境中成熟的弓形虫卵囊。 经了解养殖场周围常有野猫出入，猫作为弓形虫的终末宿主，其身上可能携带弓形虫病原体，出入养殖场过程中，其排出的粪便可能会污染喂食鸽子的饲料及饮用水等。 且年龄因素与鸽子感染弓形虫无相关性，一旦误食带有弓形虫卵囊的饲料均会感染弓形虫。 因此，制定驱虫程序时应双管齐下，防止进一步扩大弓形虫感染。 饲料应进行煮熟加工处理，饮用水也应煮沸消毒后再投喂； 严格防止野猫出入，做好灭鼠工作的同时定期对鸽子进行检测和驱虫。

通过IHA 检测结果我们可获悉，该地鸽子存在弓形虫感染。 但本次调查结果显示，IHA 检出的13 份阳性样品用巢式PCR 仅检出1 份阳性，由弓形虫的生活史可知，弓形虫主要以缓殖子的形式存在于宿主组织器官中，短期内发育为速殖子随血液循环到达机体其他器官，血液中便不再有弓形虫抗原[10]，因此，通过巢式PCR 检测可能出现漏检现象。 IHA 检测结果仅能为弓形虫病血清学检测提供参考依据，并不能完全确定被检鸽子是否携带有弓形虫病原体，将血清学检测方法和巢式PCR检测方法结合使用能更准确地掌握鸽子弓形虫的感染情况。

本次调查主要针对云南玉溪地区的鸽子，目前国内关于鸽子弓形虫的研究还较少，可参见姚秋霞等[11]、Yan C[12]、Wei Cong[13]、L Ma[14]的鸟类和禽类弓形虫感染情况的报道，血清阳性率分别为34.28%、8.7%、11.86%、17.6%。 从上述报道看出，鸟类弓形虫病虽相较于哺乳动物来说更为少见，但全国大部分地区仍存在禽类和鸟类弓形虫的感染。 鸟类活动范围广泛，更易接触到弓形虫病原体，对人类和其他动物构成潜在的感染风险，需引起重视。 由于本次试验样本量少，该试验结果仅能反映局部流行情况，但加强玉溪乃至整个云南省鸽子饲养管理及弓形虫病综合型防控显得十分必要。