廖乾秀，古建辉

（1.成都市第一人民医院 医学检验科，四川 成都；2.成都市第三人民医院 普外科，四川 成都）

0 引言

现阶段研究表明长链非编码 RNAHOTAIR 在多种肿瘤( 肝癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌等)中异常表达，并有多个研究表明 HOTAIR 的表达量与肿瘤患者的转移、进展及预后有重要的联系，体外实验发现HOTAIR 具有促进细胞增殖、侵袭、迁移和降低化疗药物敏感性等功能，目前结直肠肿瘤(Colorectal cancer)是人类常见的恶性肿瘤之一，在世界上的各类肿瘤中发病率排在第三位，死亡率排在第二位，每年增加 约100 万个患者。 目前结直肠肿瘤的发病率与死亡率在我国均呈上升趋势，严重危害人类健康。 但是其发病机制至今尚未完全阐明，既往研究多关注于蛋白编码基因 Kirsten 鼠肉瘤病毒致癌基因(Kirstenrat sarcoma viral oncogene homolog ，K -ras)、腺瘤性息肉病基因(Adenomatous polyposis coli ，APC) 和p53 等的表达异常。 近年来，长链非编码RNA(Long non -coding RNAs，lncRNAs) 在肿瘤发生发展中的作用日益受到重视，发现与直肠肿瘤相关lncRNAs 将有助于进一步阐明其发病机制，同时也能为结直肠肿瘤的诊治提供新靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015 年1 月至2017 年12 月在我院就诊的结直肠癌患者作为研究对象，并收集术后结直肠癌手术切除标本240 例，并选取距肿瘤＞5cm 的正常结直肠组织作为对照。其中男130 例，女110 例，年龄39—79 岁，平均(57.5±10.6)岁。根据2015 年国际抗癌联盟(UIcc)制定的TNM 分期标准进行临床分期，I 期30 例，Ⅱ期80 例，Ⅲ期100 例，Ⅳ期30 例。所有患者术前均未接受过任何放化疗或分子靶向治疗，手术切除的标本立即放入液氮中保存，随后转入一80℃冰箱保存，整个收集、运输及保存过程均按照无酶原则操作。

1.2 试剂与仪器

1.3 方法

1.3.1 基因间长链非编码RNA-p21(Long intergenicnoncodng RNA-p21，LincRNA -p21)

LincRNA-p21 定位于人类第6 号染色体短臂(6p21.2) 上，长度为2953bp，位于细胞质膜内面。LincRNA-p21 基因是p53 基因重要的下游基因之一，其表达产物p21 蛋白是目前已知的具有最广泛激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白。P53 作为一种肿瘤抑制蛋白可以通过与E6 原癌蛋白结合来下调p21 蛋白表达水平，阻滞细胞周期，从而促进肿瘤的发生发展。2013 年，Zhai 等实验证明了p53 途径的激活可以使结直肠肿瘤细胞中lincRNA-p21 的表达水平升高，而且与配对的正常结肠组织样本相比，lincRNA-p21在结直肠肿瘤患者样本中的含量显著降低，并且lincRNA-p21 表达水平与大肠癌分期、肿瘤组织及周围血管浸润范围和深度密切相关，进而揭示了lincRNA-p21 在结直肠肿瘤中起肿瘤抑制的作用。

1.3.2 细胞培养和转染人结直肠癌株

SCG7901 细胞培养基为含10%的小牛血清、链霉素100mg/mL、青 霉 素100u/m1 的RPMI 1640 培 养 基，sCG790l 细 胞 的培养 在37 ℃、5%C0，相对 湿 度90% 的培养 箱中，间隔2—3 天更换培养基。参照li—pofectamine。”2000 转染试剂说明书将si—HOTAIR 序列转染人sGc7901 细胞中，以乱序的negative contr01(Nc) 作为对照。取对数生长期细胞用于细胞转染，转染前10 斗llipo—fectamine 2000 加入 到240 斗l optimum 中，混匀并静置10min，在取HOTAIR 干扰序列50nmol 溶于opIimum，混匀并静置10min；PBS 冲洗2 次。转染6h 后加人RPMI 1640 培养液培养48h。

1.3.3 MTT 检测细胞增殖抑制

将转染Nc 和HOTAIR 干扰序列后48h 的sGC7901 细胞分别以4×104/孔接种于96 孑L 培养板中，每孔200 一。于接种后6、12、24、48、72、96h 每组取6 孔，加入M，ITI’(四甲基偶氮唑蓝)20肛l(5mg/m1)，温育4h 弃上清，加入DMS0( 二甲基亚砜)150 斗l，微振荡10min，于波长490nm 酶标仪检测吸光度(A) 值。细胞增殖率=(实验组A 值/阴性对照组A 值)×100%。

1.3.4 流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡

细胞转染48 小时后，用无EDTA 的胰酶消化收集SGC790l 细胞，调整细胞总数需要约1×106 个，5000r/min 离心3 min，弃上清后加PBS 重悬2 次并离心。加500 斗1 的Binding Buffer 重悬，先后加入5 斗l Annexin V—FITC 和5¨l Propidium Iodine 混匀，避光15min 后上流式细胞仪检测。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 qRT—PCR 检测HoTAIR 的表达水平

240 例结直肠癌患者中，肿瘤组织中的HOTAIR 的表达水平(6.52±2.36)显著高于正常结直肠组织中的表达水平(4.8l±1.61)(P=0.001)。 用qRT—PCR 检 测HOTAIR 在 人 结 直 肠 癌 细 胞株MKN28、sGc7901、BGc823 及 正 常 结 直 肠 上 皮 细 胞GES 一1 的表达水平，发现上述四株细胞株HOTAIT 表达水平分别为：(9.52±0.42)、(13.61±0.38)、(8.41±0.63) 和(3.3±0.62)，人 结 直肠癌细胞株中HOTAIR 表达水平明显高于正常结直肠上皮细胞(P＜0.05)。由于sGC7901 细胞株的H0 一TAIR 表达水平最高，以sGC7901 为研究对象进行转染。

2.2 HoTAIR 表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系

结直肠癌患者肿瘤组织中HOTAIR 的表达水平与肿瘤的大小及临床分期明显相关(P＜0.05)。肿瘤直径大的、分期晚的癌组织中HOTAIR 表达水平明显增高。癌组织中HOTAIR 表达水平与患者性别、年龄、吸烟状况及分化程度无明显统计学差异(P＞0.05)，表1。

2.3 MTT 法检测细胞增殖能力

我们用MTT 法检测转染si—HOTAIR 后对sGc7901 增殖能力的影响，转染后12 小时之内，sGc7901 增殖未受到明显影响，但是自转染24 小时后细胞增殖能力开始明显比对照组下降。转染si—HOTAIR 24h、48h 及76h 细胞的抑制率分别为：24.6%、31.4%和38.5%。

2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

si—HOTAIR 转染至SGC7901 细胞48h 后，用FcM 分析各组细胞凋亡的变化。si—HOTAIR 组细胞凋亡率为：(24.3±2.3)%，si—Nc 组细胞凋亡率为：(6.72±1.3)%，与si—NC 组比较，si—HOTAIR 转染后可明显促进细胞凋亡(P＜0.05)。

本次研究中有一些限制需要指出：①部分研究不能直接从原文献获得资料，我们通过其生存曲线提取HR 估计；②不同研究中高和低HOTAIR 表达的截断值不同，不能达到统一的标准；③因为常常结果为阴性的实验研究通常不太可能被公开，大部分的纳入研究报告阳性结果；④本次Meta 分析仅仅纳入了英文文献，这可能为发表偏倚的原因之一；⑤由于不同病理亚型的肿瘤的预后会有很大的不同，纳入的文献中均未具体指出其研究消化道肿瘤的具体病理亚型，这亦可使HOTAIR 与肿瘤不良预后关系大小受到影响。总之，消化道恶性肿瘤组织中HOTAIR 表达上调与患者的不良预后有很大关联。提示HOTAIR 可作为一种新的预测因子用于消化道肿瘤预后的判断。患者HOTAIR 表达水平可指导术后治疗； HOTAIR 可作为肿瘤治疗新药物的靶点。

表1 HOTAIRmRNA 表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系

表1 HOTAIRmRNA 表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系

病理参数 n HOTAIRmRNA 表达量 P 值性别 男 28 0.38±0.12 0.51女 18 0.41±0.16年龄 ≤60 岁 18 0.45±0.16 0.09＞60 岁 29 0.38±0.14肿瘤大小 ＜3cm 16 0.46±0.23 0.26≥3cm 30 0.38±0.19肿瘤位置 结肠 18 0.39±0.18 0.46直肠 26 0.36±0.16分化程度 高 28 0.38±0.12 0.038低 16 0.46±0.11淋巴结转移有 29 0.42±0.08 0.019无 18 0.38±0.06 TNM 分期 Ⅰ、Ⅱ 14 0.43±0.06 0.038Ⅲ、Ⅳ 36 0.39±0.08