茅荣鑫，胡庆★，刘展菱，刘开玲，刘秋萍

（1.南宁市第六人民医院，广西 南宁；2.广西医科大学第一附属医院，广西 南宁；3.南宁市第八人民医院，广西 南宁）

0 引言

带状疱疹是水痘-带状疱疹病毒（VZV)感染性疾病，多发生于老年人及体质较差者。有临床研究表明[1]，约有10%的带状疱疹患者并发带状疱疹后遗神经痛，带状疱疹后遗神经痛导致的疼痛、失眠、抑郁等严重影响了患者的生存质量。目前带状疱疹的发病机制尚未完全清楚，且临床上治疗带状疱疹的方法虽多，但疗效均不尽如意、作用机理尚不十分清晰。因此，深入研究带状疱疹的发病机理，为今后寻找更加有效的治疗方法提供理论依据已成为当务之急。因此，本研究分析了2018 年6 至2018 年12 月本院收治的40 例带状疱疹患者的T 淋巴细胞亚群的变化及其与Bcl-2表达的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2018 年6 月至2018 年12 月南宁市第六人民医院收治的符合纳入标准的带状疱疹患者40 例作为实验组，并选取同期内该院体检科经检查无异常的健康志愿者40 人作为对照组，实验组男18 例，女22 例，年龄37-66 岁，平均年龄52.73±6.83 岁；对照组男性20 人，女性20 人，年龄39-67 岁，平均年龄53.58±6.71 岁，两者性别、年龄的差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经南宁市第六人民医院医学伦理委员会批准，且所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 诊断标准

参照带状疱疹中国专家共识[2]进行诊断：由VZV 再活化引起的一种病毒性皮肤病，有成簇水疱，沿神经分布，排列成带状，单侧性，有明显神经痛。

1.3 纳入标准与排除标准

纳入标准：（1）符合上述带状疱疹诊断标准；（2）初次发病，病程小于等于7 天，年龄45-70 岁之间；（3）未经相关治疗；（4）无认知障碍，了解本研究项目流程，同意参加本实验并签署知情同意书。排除标准：（1）伴有严重的心、肺等系统性疾病者；（2）有严重中枢神经系统并发症；（3）恶性肿瘤患者；（4）妊娠及哺乳期妇女；（5）已接受带状疱疹相关治疗措施者。

1.4 样本的采集与检测

实验组患者就诊当天、未采取相关治疗措施之前，于肘静脉处抗凝管采集患者外周血5mL，采用流式细胞仪检测CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞水平和比例以及其表面Bcl-2 抗原的表达，具体操作方法如下。

1.4.1 外周血T 淋巴细胞分离

①实验进行前将Hanks 应用液配制好待用（一份原液—份双蒸水，混合搅拌均匀后分装，榜高压蒸汽灭菌，使用前用无菌的溶液调节PH 至7.2-7.6）；②将抗凝血轻柔摇晃，使血液混合均匀，与Hanks 应用液以比例混匀稀释；③在无菌状态下将人类淋巴细胞分离液加入刻度离心管中；④用吸管将稀释旳血液沿离心管缓慢地加入到人类淋巴细胞分离液液面之上。稀释血液体积与淋巴细胞分离液体积两者总高度不超过刻度离心管的三分之二，拧紧离心管管盖；⑤将刻度离心管置于离心机中，配平后1500rpm 离心15min；⑥离心后可见管内分为四层，从上至下分别为：血浆层、白膜层（本实验所需层）、人类淋巴细胞分离液层、粒细胞及红细胞层；⑦用吸管小心吸出白膜层，置于管中，-80°C 保存，待检。

1.4.2 T 细胞亚群检测

①取两个EP 管分别标记A、B；②将抗凝全血标本混合均勾，移液器吸取抗凝全血分别加入两个EP 管中；③A 管中加入抗人类CD4-FITC/CD8-PE T 细胞流式抗体2.5uL；B 管加入PE-Cy5鼠IgG1 同型对照抗体10uL、FITC 鼠IgG1 同型对照抗体2.5uL 以及PE 鼠IgG1 同型对照抗体2.5uL（以上步骤避光操作）；④4°C避光孵化30min；⑤孵育完毕后，两管中均加入人类红细胞裂解液500uL，避光，4°C 裂解10-15min；⑥加入PBS 缓冲液1000uL 终止裂解；⑦低温超速离心机4°C，400xg，离心5min，去上清，加入PBS缓冲液1000uL 吹打混匀，重复低温超速离心，去上清；⑧加入PBS缓冲液1000uL 吹打混匀后，加入96 孔板中，每孔200uL，设复孔，流式细胞仪检测，设门，做两色荧光流式细胞检测，测定CD4+T 淋巴细胞以及CD8+T 淋巴细胞，检测两种标记细胞百分比。

1.4.3 CD4+T 淋巴细胞表面Bcl-2 的检测

①取2 支EP 试管A、B；②A、B 中分别加入CD4+10uL 和悬液100uL；③室温避光10min；④加500uL 破膜剂（1×perm）避光10min；⑤用含0.5%的胎牛血清和0.1%叠氮钠的PBS 洗一次；⑥离心1500r/min 5 分钟弃上清液；⑦A 中加20uL Bcl-2FITC 抗体混匀，B 中加IgG-FITC 对照，室温避光30 分钟；⑧用含1%的叠氮钠的PBS 洗1 次；⑨离心1500r/min 5 分钟弃上清液；⑩加入500uL PBS 混匀上机。

1.4.4 CD8+T 淋巴细胞表面Bcl-2 的检测

操作步骤同CD4+T 淋巴细胞表面Bcl-2 的检测。

1.5 统计学处理

所有数据均采用SPSS 16.0 统计软件进行统计处理分析，正态分布的计量资料使用均数±标准差表示，两组间的比较采用两独立样本t 检验，运用pearson 相关性分析探索CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞计数与Bcl-2 表达的相关性。以P＜0.05作为差异具有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 各组CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞水平及其比例的比较

与对照组相比，实验组患者CD4+T 淋巴细胞明显降低（P＜0.05）、CD8+T 淋巴细胞明显增高（P＜0.05），CD4+T 淋巴细胞/CD8+T 淋巴细胞明显降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组CD4+、CD8+T 淋巴细胞水平、比例的比较（n；%）

2.2 各组CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞表面Bcl-2 表达的比较

与对照组相比，实验组患者CD4 +T 淋巴细胞表面Bcl-2 的表达明显降低（P＜0.05）、CD8+T 淋巴细胞表面Bcl-2 的表达明显升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组CD4+、CD8+T 淋巴细胞表面Bcl-2 表达水平的比较（n；%）

2.3 带状疱疹患者的CD4+、CD8+T 淋巴细胞水平与Bcl-2表达的相关性

带状疱疹患者CD4+T 淋巴细胞与Bcl-2 的表达呈正相关（P＜0.05），CD8+T 淋巴细胞水平与Bcl-2 的表达呈正相关（P＜0.05）。见表3。

表3 带状疱疹患者的CD4+、CD8+T 淋巴细胞水平与Bcl-2 表达的相关性

3 讨论

现代医学研究表明，机体对VZV 的免疫主要是由T 淋巴细胞活化介导的[3]，VZV 初次感染后，机体产生针对VZV 特异性的T淋巴细胞，由其释放多种细胞因子、颗粒酶和穿孔素清除VZV，随后部分VZV 特异性T 淋巴细胞活化后自发诱导凋亡，部分则成为记忆性CD4+ 和CD8+T 淋巴细胞。但是由于某些自身或外界因素的影响，使得记忆性T 淋巴细胞数量减少，从而导致带状疱疹的发生，严重时疱疹泛发全身。

CD4+ 是辅助性T细胞表面标志，其主要功能是协助B 细胞产生抗体、增强B细胞介导的体液免疫和辅助其他淋巴细胞的功能；CD8+细胞代表抑制性和细胞毒性T淋巴细胞，能够抑制B淋巴细胞活性，抑制抗体的合成、分泌及T细胞的增殖，因而，CD8+细胞增加不利于抗体产生、疾病的控制。已有研究表明带状疱疹患者免疫功能异常，在细胞免疫应答方面存在免疫抑制[4-5]，细胞免疫抑制主要是由CD4+T 淋巴细胞降低、CD8+T 淋巴细胞升高、CD4+/CD8+ 比例降低所致[6-8]，且均和带状疱疹的临床特征有一定的相关性[9]。本研究结果显示，带状疱疹患者较健康志愿者的CD4+T 淋巴细胞降低（P＜0.05）、CD8+T 淋巴细胞升高（P＜0.05）、CD4+/CD8+比例降低（P＜0.05），与上述国内外研究结果一致[6-8]。

细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。对免疫系统而言，细胞凋亡不仅是免疫系统发育过程中必不可少的一个环节，而且是免疫系统行使功能的一种方式。已有研究表明，T淋巴细胞凋亡参与了带状疱疹的发生、发展[10]，另有研究发现[11]，凋亡抑制蛋白c-FLIP 参与了带状疱疹患者VZV 细胞免疫，但非唯一相关因素。因此，进一步研究带状疱疹患者T 淋巴细胞亚群上凋亡相关信号分子的表达、细胞内凋亡信号传导途径，将有助于阐明带状疱疹的发病机制。

Bcl-2 基因是研究最早的与凋亡有关的基因，其是阻止凋亡的最后共同通路，通过阻止受损DNA 翻译成参与细胞凋亡的的信号，或通过阻止凋亡基因产物的活化来实现的，从而保护多种细胞免于各种诱因所致的细胞凋亡[12]。已有研究表明，在诸多由T 淋巴细胞活化介导为主的免疫疾病中，均发现与凋亡途径、分子Bcl-2 相关[13,14]。本研究结果显示，带状疱疹患者CD4+T 淋巴细胞表面的Bcl-2 的表达低于健康志愿者，CD8+T 淋巴细胞表面的Bcl-2 的表达高于健康志愿者，并且CD4+、CD8+T 淋巴细胞水平的变化均与其表面Bcl-2 的表达呈正相关，提示带状疱疹患者T淋巴细胞亚群的改变，可能与Bcl-2 调控的细胞凋亡相关。

综上所述，带状疱疹患者存在CD4+T 淋巴细胞降低、CD8+T淋巴细胞升高、CD4+T 淋巴细胞降低/ CD8+T 淋巴细胞升高，其机制十分复杂，Bcl-2 调控的细胞凋亡可能是其变化的原因之一。仍需进一步的临床及基础研究以明确其机制，为今后寻找带状疱疹靶向药物治疗、提高临床上带状疱疹的治疗效果、减少带状疱疹患者的痛苦提供更多的理论依据。