杜佳，侯渊博

（1 中国科学院肿瘤与基础医学研究所，中国科学院大学附属肿瘤医院检验科，浙江省肿瘤医院检验科，浙江 杭州；2 浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科，浙江 杭州）

1 背景介绍

近 年 来，多 重 耐 药（multidrug-resistant， MDR）和 全 耐 药（pan-drug-resistant， PDR）肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌愈发增多，这些细菌往往携带碳青霉烯酶，此酶可以使绝大多数β 内酰胺类抗菌药物失活，并且这些细菌还携带可以水平转移的耐药质粒，进一步加剧了耐药传播[1]。针对这些耐药细菌，目前临床尚缺乏有效的治疗措施，迫使临床医生选择已摒弃使用的多粘菌素和磷霉素进行治疗，但是治疗效果都不理想[2]。

体外实验表明MDR 细菌通常对多粘菌素表现敏感，但是随着临床用量的增加，细菌对多粘菌素的耐药率呈逐年递增的趋势。目前用药指南明确指出磷霉素只适用于治疗尿路感染，这样做的目的是可以降低耐药率的发生[3]。由于MDR 细菌对多粘菌素非常敏感，耐药率极低，因此多粘菌素被认作为最后一道“防线药物”[4]。本综述主要针对目前多粘菌素耐药机制及耐药变迁做阐述。

2 多粘菌素介绍

多粘菌素是一种具有杀菌活性的阳离子肽类物质，最早于1947 年从土壤细菌Paenibacilluspolymyxa 中分离得到。目前用于临床治疗的主要是多粘菌素B 和多粘菌素E，二者在结构上只有一个氨基酸不同，但效果却明显不同[5,6]。相比多粘菌素B 更为直接激进的作用效果，多粘菌素E 反而会更温柔迟缓一点，毒力也较弱，因此也更多的用于临床治疗[7,8]。

多粘菌素的作用位点是革兰阴性菌的外膜，与脂多糖（LPS）脂质A 的磷酸基团亲和。具体机制为，脂质A 带负电荷，两端被二价阳离子Ca2+ 和Mg2+ 包围，多年菌素带正电荷可以替换Ca2+ 和Mg2+ 破坏细菌外膜的稳定性，渗透性改变、细菌内容物流失、细菌死亡[9]。

多粘菌素除了具有良好的杀菌作用外，还具有比较严重的副作用，如神经毒性和肾毒性。正是因为这些副作用，多粘菌素于1970 年被β 内酰胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类抗菌药物替代。最近几年由于细菌对这些药物耐药率愈发增高，多粘菌素又重新用于临床。值得注意的是，多粘菌素除了临床上使用外，一些国家在养殖业上存在过度使用多粘菌素的现象[10,11]，这也是导致多粘菌素耐药率增高的原因之一。

3 耐药机制

3.1 天然耐药

由于多粘菌素的作用位点是LPS，所以它的抗菌谱比较窄，其中包括大部分的革兰阴性菌。革兰阳性菌和一些厌氧菌外膜中没有LPS，所以多粘菌素对这些细菌无作用。还有一些细菌如普罗威登丝菌属、爱德华菌属、布鲁士菌属、军团菌属及摩根摩根菌等均对多粘菌素天然耐药，原因可能是由于这些细菌基因表达的阳离子产物添加到LPS，导致细菌外膜与多粘菌素亲和力下降引起[12]。

3.2 基因表达水平改变引起耐药

多数肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌及嗜麦芽窄食单胞菌对多粘菌素敏感[13]。这些细菌出现对多粘菌素耐药跟上述天然耐药细菌一样是LPS 结构发生改变导致。

目前在肠杆菌科细菌中，研究最多的主要为两种分子结构——pEtN 和L-Are4N[10,14]。耐药的产生是由于这两种分子结构添加到LPS 上引起细菌外膜与多粘菌素亲和力下降[15]。这两种分子是由LPS 修饰酶基因pmrC、pmrE 和pmrHFIJKLM 表达控制，这些基因的表达则受控于PmrAB 和PhoPQ 双组分系统[16-18]。除此之外，mgrB 和crrAB 也参与调控，MgrB 抑制PhoPQ 的表达，CrrAB 参与调控PmrAB 表达[19-22]。具体耐药机制是由于参与调控这些信号通路中的某些基因发生突变引起，已知的有pmrA、pmrB、phoP 和phoQ 基因发生突变、mgrB 基因出现插入或缺失突变及crrB 基因发生突变。

在肺炎克雷伯菌中，其荚膜多糖可以阻止多粘菌素与外膜相结合[23,24]。另外一些外排泵（AcrAB 和KpnEF）的存在可以加速多粘菌素的外排，这些都可引起多粘菌素敏感性下降[25,26]。除了PmrA/PmrB 和PhoP/PhoQ TCS 外，铜绿假单胞菌中还存在ColR/ColS 和CprR/CprS TCSs 参与调控多粘菌素耐药。在phoQ 突变菌株中如果ColR/ColS 和CprR/CprS TCSs 也发生基因突变，该菌株会出现高耐药表型[27]。由此看来，ColR/ColS 和CprR/CprS TCSs与PhoP/PhoQ TCS 可能存在交叉作用，colR/colS 和cprR/cprS 基因增强了PhoQ 的活性和LPS 结构发生添加L-Ara4N 改变的能力，进而导致高水平耐药。这种效应可因colR/colS 和cprR/cprS 基因发生突变而受抑制。研究还表明ColR/ColS 和CprR/CprS TCSs 还可以调控其他未知基因表达水平介导L-Ara4N 修饰作用[27]。

3.3 异质性耐药

临床工作者在检测大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌多粘菌素药敏的时候往往会遇到异质性耐药现象。这种现象在用BMD 方法检测时出现“跳空”或用纸片扩散法检测是抑菌圈内出现菌落生长可以说明。当把这些菌落挑选出来继续检测药敏发现异质性耐药仍然存在。

图1 CrrAB 介导多粘菌素耐药及与PmrAB 和PhoPQ 之间关系[22]

在肺炎克雷伯菌研究中，Aurélie Jayol 等人发现，在对多粘菌素耐药菌株用Etest 方法检测多粘菌素的MIC 时，在抑菌圈当中出现散在的小菌落，作者将这些小菌落进行分纯培养后，经PCR检测发现此菌株存在PhoP(D191Y) 氨基酸替换，敲除回补试验表明此突变介导菌株对多粘菌素耐药[28]。Ana Silva 等人在研究肺炎克雷伯菌生物膜特性中，通过菌谱分析（Population analysis profile， PAP）方法发现在生物膜状态下检测到一种菌体较小的菌株，经分析后发现此菌株对多粘菌素的耐药表型比较固定，可能是细菌处在生物膜状态下，经群体感应系统的调节出现了异质性耐药现象[29]。Myung-Jin CHOI 等人研究发现，与敏感株相比多粘菌素耐药菌株HV 表型及CPS 表达量都发生下降，耐药株的抗血清及生物膜形成能力也都发生降低。体外竞争试验也发现耐药株的竞争优势下降[30]。

Li 等人在鲍曼不动杆菌中发现，临床分离的菌株中有90%的菌株对多粘菌素异质性耐药。这些亚群菌株与增加多粘菌素耐药和再生长有着密切关系[31]。但是，鲍曼不动杆菌对多粘菌素异质性耐药的机制目前还不清楚。Alejandro Beceiro 等人研究发现，lpx 突变的菌株体外生长能力明显下降，体外竞争和毒力也比敏感菌株有明显下降[32]。

在阴沟肠杆菌科（Enterobacter cloacae complex， ECC）研究中发现，E.cloacae 菌株对多粘菌素耐药具有一定的种群特异性，深入研究机制后发现，ECC 中多粘菌素异质性耐药是由于PhoPQ双组分调控系统控制arn 操纵子基因表达引起的。与E.coli，S.enterica 和K.pneumoniae 不 同 的 是，ECC 菌 株 中PmrAB 和PhoPQ 之间不存在交叉关系[33]。

3.4 质粒介导耐药

Liu 等人[34]首次发现了质粒介导多粘菌素耐药基因——mcr-1。该基因阳性标本主要来源于动物，人源性标本阳性率要远低于动物源性标本，可能是跟多粘菌素药物在畜牧业的使用量较大有关系。研究还发现，mcr-1 基因具有较强的传播性，可以转移到肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌中，且mcr-1 可以与不同的耐药基因整合于同一个转移性质粒上，因此这种质粒具有较强的危险性。

自mcr-1 基因首次发现后，世界范围内（包括欧洲、南亚、非洲和美洲地区等）出现了大量关于mcr-1 的报道[35-41]，说明mcr-1成为全球性问题是不可避免的。目前mcr-1 基因主要存在于大肠杆菌中，在沙门菌和肺炎克雷伯菌中也有检出，但报道较少。鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中至今未有报道。Yu 等人首次报道了一例整合在耐碳青霉烯大肠杆菌染色体上的mcr-1 基因，这可能与mcr-1 基因在传播过程中发生了衍变有关。虽然mcr-1 基因在2015 年首次报道，但是有研究报道显示2012 的大肠杆菌中也有检出mcr-1 基因，根据目前结果推测mcr-1 基因的出现有可能会更早。mcr-1 基因在人、食物、水、农场养殖动物甚至迁徙的鸟类源性标本中均有检出[34，40，42]，在多重耐药菌如产ESBL 和碳青霉烯酶的大肠杆菌中也有报道[43,44]。且这些阳性质粒分型种类较多，提示mcr-1 基因的兼容性非常好。2016 年7 月，比利时地区来源于猪和牛的大肠杆菌中检出一种新的质粒介导多粘菌素耐药基因mcr-2[45]。该基因在牛来源大肠杆菌中的检出率要远高于mcr-1 的检出率。MCR-1 和MCR-2 具有80.65%的蛋白相似度，同属于磷酸乙胺醇家族，可介导lipidA 添加磷酸乙胺醇基团引起细菌LPS 与多粘菌素亲和力下降[34]。在Liu 等人[34]的研究中，携有mcr-1 的质粒命名为pHNSHP45，是一个大小为64Kb 左右的IncI-like 质粒，预测有83 个开放阅读框架（ORFs），G+C 含量为42.7%。该质粒最早在2013 年7 月份的一株来源于养猪场分离的大肠杆菌分离得到。药敏结果显示该大肠杆菌对大多数的抗菌药物都耐药，但是对碳青霉烯类药物保持敏感[34]。携带mcr-2的质粒命名为pKP37-BE，是一个大小为35Kb 左右的IncX4 型质粒，G+C 含量为41.3%，不携带其他耐药基因。目前为止，已有8种mcr 基因突变体被报道（mcr-1， mcr-2， mcr-3， mcr-4， mcr-5， mcr-6， mcr-7， mcr-8）[36-42]，且携带mcr 基因的质粒载体种类多变，此现象也加剧了mcr 基因的传播，由此带来的传播危害值得密切关注。

3.5 交叉耐药

根据目前研究结果发现，一些多粘菌素年耐药的革兰阴性菌并没有出现双组分调控系统中相应基因突变，也不存在异质性耐药、质粒介导耐药。对于这些菌株耐药机制是如何产生的，交叉耐药可能是最好的解释。有研究表明，医用消毒剂（如洗必泰）在临床消毒过程中广泛使用，可能引起了细菌多多件菌素的交叉耐药[46]。洗必泰以种阳离子形式存在，它可以替换细菌外膜磷脂双层中的二价阳离子（Ca2+ 和Mg2+）导致细菌外膜结构瓦解，细菌内容物外泄死亡。

综上可以看出洗必泰的杀菌机制与多粘菌素相似，都是与细菌的外膜结合。Matthew E et al 等人[46]研究发现，通过体外诱导试验使肺炎克雷伯菌对洗必泰耐药，这些耐药菌同时产生了对多粘菌素耐药。肺炎克雷伯菌对洗必泰的耐药机制与phoPQ 和smvR 基因突变有关，smvR 基因是Tet 抑制基因，与外排泵基因smvA 相邻。smvR 基因发生突变后，smvA 基因的表达量升高。而体外诱导肺炎克雷伯菌对多粘菌素耐药后，并不会产生对洗必泰耐药。根据Matthew E et al 等人研究结果可以发现，肺炎克雷伯菌对多粘菌素耐药可能与消毒剂的使用有交叉关系，这为临床预防感染提供一定帮助。

4 结论与展望

近年来由于新药的缺乏，临床较多使用多粘菌素治疗MDR 革兰阴性菌引起的感染以及畜牧业中多粘菌素的滥用导致了多粘菌素耐药率的升高。值得警惕的是，质粒介导到多粘菌素耐药的出现加剧了耐药的传播。因此，多粘菌素耐药机制的研究在学术上受到了较多关注。

正是由于新药的缺乏，在治疗MDR 革兰阴性菌感染方面，多粘菌素可能还会处于主力地位。目前，一种新型复合制剂药头孢他啶/阿维巴坦用于临床治疗。这种复合制剂是一种β 内酰胺抗生素和有一种β 内酰胺酶抑制剂的组合，这种β 内酰胺酶抑制剂只能抑制A 类碳青霉烯酶，对B 类金属β 内酰胺酶无效，因此这种复合制剂并不能广泛使用。Mcr 抑制剂目前仍处于研究阶段，真正运用于临床还尚需较长时间。因此，有效的感染控制措施（如抗生素管制和耐药监测）是目前应对最近出现的多粘菌素耐药问题的首要方案。