马宝丰 李铁成 徐芳

(锦州医科大学附属第三医院麻醉科，辽宁 锦州 121001)

乳腺癌发生于乳腺腺上皮组织，近年来女性乳腺癌发病率和死亡率都呈明显上升趋势，严重威胁女性健康〔1〕。据统计，2015年世界乳腺癌新发病患者约240万例，死于乳腺癌的患者约52万例〔2〕。外科手术治疗、放化疗、靶向治疗、内分泌治疗等多种乳腺癌临床治疗方式虽可降低患者死亡率、延长患者生存期，但治疗后出现癌细胞的转移及放化疗的毒副作用是乳腺癌导致患者治疗效果不佳的主要原因〔3～5〕。麻醉药在乳腺癌手术治疗中广泛应用，现如今越来越多的研究关注于麻醉镇痛药物与肿瘤生长和转移的关系，临床研究结果显示，曲马多可、咖啡酸苯乙酸酯、雷诺嗪等麻醉类药物对乳腺癌的生长和转移具有一定的抑制作用〔6～8〕。普鲁卡因(PCA)是传统的化疗药物之一，在手术中也作为局部麻醉剂使用，在肝癌的研究中发现，PCA能够使肝癌细胞生长阻滞在G0/G1期，从而显著抑制癌细胞的增殖，并具有剂量、时间依赖效应〔9〕。本研究拟探讨PCA对乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 MCF-7人乳腺癌细胞购自ATCC；胎牛血清、DMEM培养基购自美国赛默飞世尔公司；LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；TaKaRa反转录试剂盒、TaKaRa实时荧光定量试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒购自江苏碧云天生物技术公司；Transwell小室购自Corning公司；噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亚砜购于美国Sigma公司；Trizol试剂、结晶紫、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司；兔抗人蛋白激酶B(AKT)3多克隆抗体购自美国Abbiotec公司；兔抗人GAPDH多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G购自Abcam公司；control mimic和miR-15a-5p mimic、control inhibitor和miR-15a-5p inhibitor购自广州瑞博生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2细胞培养 人乳腺癌细胞MCF-7使用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，每天换新鲜培养液一次，待细胞融和至70%左右时使用胰蛋白酶消化传代。选对数生长期的细胞进行实验。

1.3细胞转染与分组 生长对数期的细胞使用0.25%胰蛋白酶消化后重悬，以1×105个/孔接种至24孔板，按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书分别将control mimic、miR-15a-5p mimic、control inhibitor、miR-15a-5p inhibitor转染至MCF-7细胞，记为miR-NC组、miR-15a-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-15a-5p组；选择转染control inhibitor和miR-15a-5p inhibitor的细胞，在培养液中加入PCA并调整终浓度为5.0 mmol/L，常规培养48 h。

将MCF-7细胞随机分为Con组、不同浓度PCA处理(0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.5 mmol/L、5.0 mmol/L、10 mmol/L)组、PCA组。处理方法：Con组不添加PCA；不同浓度PCA处理组在细胞培养基中加入PCA并调整终浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L；PCA组：以含终浓度为5.0 mmol/L PCA的培养基培养细胞。每组6个复孔，重复3次。

1.4MTT检测细胞增殖 在各组细胞培养至24 h、48 h、72 h时加入20 μl的MTT(5 g/L)溶液；孵育4 h后，去除多余培养液，加入150 μl的二甲基亚砜，震荡反应10 min，使用酶标仪检测490 nm波长处的各组吸光度值(OD)。每组设6个重复。

1.5Transwell检测细胞迁移和侵袭 取各组对数生长期的细胞，将其制备成1×104个/ml的单细胞悬液。细胞迁移实验：取200 μl细胞悬液接种到Transwell小室上室中，下室加入600 μl含10 % 胎牛血清的DMEM培养基，常规培养24 h后，取出小室，用棉签擦去上室内的细胞，PBS洗涤，甲醇固定30 min，0.1 %结晶紫染色20 min，PBS洗涤，自然风干后随机选6个视野观察穿过滤膜的细胞数，取均值。细胞侵袭实验：以1∶5比例加入DMEM培养基稀释Matrigel后，铺于Transwell小室的上室，风干成胶后，按照上述操作方法操作。最后显微镜下观察小室下表面附着的侵袭细胞。

1.6qRT-PCR检测miR-15a-5p表达量 取MCF-7细胞和PCA(5.0 mmol/L)处理的MCF-7细胞，用Trizol试剂提取总RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒说明书进行反转录，按照TaKaRa 荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系，置于实时荧光定量仪上进行PCR扩增。每个样品重复3次，以GAPDH为内参，通过2-△△Ct法分析结果。内参引物序列如下：GAPDH反义：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，正义：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

1.7Western印迹检测蛋白表达 各组对数生长期细胞加入RIPA裂解液裂解，4 ℃，10 000 r/min离心15 min，收集蛋白上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上，5 % 脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h。分别加入AKT3抗体(1∶1 000)和GAPDH抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜；加入HRP标记的二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min，电化学发光显影，每个蛋白样品重复3次。

1.8双荧光素酶报告基因实验 Targetscan在线预测发现AKT3 3′-非翻译区(UTR)上存在miR-15a-5p的结合位点，为进一步验证AKT3是否是miR-15a-5p的靶基因，构建野生型AKT3-3′UTR(WT)和突变型AKT3-3′UTR(MUT)的全长质粒载体，参照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书分别与miR-15a-5p mimic共转染至MCF-7细胞，37℃、5%CO2培养48 h后按照双荧光素酶报告基因试剂盒操作步骤进行检测，相对荧光强度=萤火虫荧光强度/海肾荧光强度。

1.9统计学分析 采用SPSS20.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1PCA对MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭的影响 与Con组相比，随着PCA浓度的增加，MCF-7细胞24 h、48 h、72 h的抑制率逐渐增强。选用作用时间48 h，抑制率约为50%的PCA浓度(5.0 mmol/ml)用作后续实验。见表1。与Con组相比，PCA组MCF-7细胞的迁移和侵袭量均显著降低(P<0.001)。见表2。

表1 不同浓度PCA对MCF-7细胞抑制率的影响

与Con组比较:1)P<0.05

表2 PCA对MCF-7细胞迁移、侵袭的影响个)

2.2PCA对miR-15a-5p表达的影响 与Con组(1.13±0.01)相比，PCA组miR-15a-5p的表达量(1.82±0.13)显著增加(t=9.166,P<0.01)。

2.3miR-15a-5p对MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭的影响 与miR-NC组相比，miR-15a-5p组MCF-7细胞的增殖抑制率显著升高，细胞的迁移和侵袭量显著降低(P<0.001,P<0.01,P<0.05)。见表3。

表3 miR-15a-5p对MCF-7细胞迁移、侵袭、增殖的影响

2.4抑制miR-15a-5p表达逆转了PCA对MCF-7细胞迁移、侵袭和增殖的抑制作用 与Con组相比，PCA组的MCF-7细胞增殖抑制率明显升高，细胞迁移和侵袭量显著降低(P<0.05)；将miR-15a-5pinhibitor转染至MCF-7细胞并经PCA处理后，与PCA+anti-miR-NC组相比，PCA+anti-miR-15a-5p组的MCF-7细胞增殖抑制率明显降低，细胞迁移和侵袭量显著增加(P<0.05)。见表4。

表4 抑制miR-15a-5p表达逆转了PCA对MCF-7细胞迁移、侵袭和增殖的抑制作用

与Con组比较:1)P<0.05；与PCA+anti-miR-NC组比较:2)P<0.05

2.5AKT3为miR-15a-5p的靶基因 Targetscan软件预测结果显示，miR-15a-5p与AKT3之间存在互补结合位点(图1)。双荧光素酶报告基因实验结果如表5所示：与miR-NC组比较，共转染miR-15a-5p mimic和AKT3 3′UTR-WT野生型载体的MCF-7细胞，荧光素酶活性显著下降(P<0.05)；共转染miR-15a-5p mimic和AKT3 3′UTR-MUT突变型载体的MCF-7细胞，荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。将miR-15a-5p mimic、miR-15a-5pinhibitor转染至MCF-7细胞中，与miR-NC组(0.61±0.06)相比，miR-15a-5p组的MCF-7细胞AKT3蛋白表达量(0.22±0.03)显著降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组(0.51±0.05)相比，anti-miR-15a-5p组的MCF-7细胞AKT3蛋白表达量(0.93±0.09)显著升高(P<0.05)。见图2。

2.6抑制miR-15a-5p的表达恢复PCA对MCF-7细胞中AKT3蛋白表达的抑制作用 与Con组(1.06±0.11)相比，PCA组的MCF-7细胞中AKT3蛋白的表达量(0.47±0.03)显著降低(P<0.05)；与PCA+anti-miR-NC组(0.42±0.03)相比，PCA+anti-miR-15a-5p组的MCF-7细胞中AKT3蛋白的表达量(0.76±0.06)显著升高(P<0.05)。提示，抑制miR-15a-5p恢复了PCA对MCF-7细胞AKT3蛋白表达的抑制作用。见图3。

图1 AKT3的3′UTR中含有miR-15a-5p的互补核苷酸序列

表5 双荧光素酶报告实验

1～4：miR-NC组,miR-15a-5p组,anti-miR-NC组,anti-miR-15a-5p组图2 各组AKT3蛋白的表达

图3 各组AKT3蛋白的表达

3 讨 论

我国2015年乳腺癌新发病例约27万，占全国恶性肿瘤的15%，死亡7万例〔10〕。目前手术切除仍然是乳腺癌的主要治疗手段，有可能造成癌细胞种植、增生和转移，在临床研究中发现，麻醉药物与肿瘤细胞直接作用可影响肿瘤生长、侵袭和转移，对化疗药物的敏感性也有影响〔11〕。PCA是常用的局部麻醉药物之一，在某些癌症中被证明是一种潜在的DNA甲基化抑制剂，甲基化水平增高可使抑癌基因失活，促进肿瘤的生长〔12〕。在胃癌〔13〕、结肠癌〔14〕中，PCA显著降低了整体DNA甲基化水平，并对癌细胞有生长抑制和凋亡诱导的作用，从而抑制癌症的发展。PCA可将乳腺癌细胞MDA-MB-231阻滞在S期，降低细胞存活率，抑制其迁移〔15〕。本研究发现，PCA对乳腺癌细胞的增殖具有抑制作用，且呈浓度、时间依赖性；PCA(5.0 mmol/L)处理的MCF-7细胞其迁移和侵袭量均明显降低。

microRNA是在生物体内发现的一类长度为21-25nt的非编码小分子RNA，参与细胞的生长、分化和细胞周期调控等多个环节，并且miRNA在导致细胞癌变及癌细胞增殖和转移等各阶段具有关键作用〔16〕。miR-15a-5p是miR-15家族的一个成员，由位于染色体13q14区域内的基因编码，以往研究发现，miR-15a在乳腺癌细胞MCF-7中明显低表达，miR-15a可通过靶向于抗凋亡基因B细胞淋巴瘤(Bcl)-2诱导乳腺癌细胞凋亡〔17〕。多项研究表明，miR-15a-5p在子宫内膜癌〔18〕、肺癌〔19〕、肝癌〔20〕的组织及细胞中均呈低表达，过表达miR-15a-5p可抑制癌细胞的增殖和迁移能力及癌细胞的上皮间质转化。本研究发现，PCA处理的MCF-7细胞中miR-15a-5p的表达水平显著上调，过表达miR-15a-5p可抑制MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭；将miR-15a-5p inhibitor转染至MCF-7细胞并经PCA处理后，MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著提高。

AKT是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，AKT家族主要包括AKT1、AKT2、AKT3三种亚型，AKT是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信号通路下游的主要效应分子，在细胞代谢、细胞生长凋亡等多种生物学过程中发挥重要作用〔21〕。AKT作为一种原癌基因，已成为医学界的关注热点，在乳腺癌的研究中，AKT3过表达可增强乳腺癌细胞的增殖，增加癌细胞致瘤性〔22〕。本研究通过预测发现了AKT3是miR-15a-5p的靶基因，并运用荧光素酶报告基因实验验证了miR-15a-5p与AKT3之间的靶向关系。PCA处理的MCF-7细胞中AKT3表达下调，抑制miR-15a-5p恢复了PCA对MCF-7细胞AKT3表达的抑制作用。

综上，PCA能够抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖、迁移和侵袭能力，可能是通过调控miR-15a-5p/PI3K-AKT3途径的表达来实现的。