康芦兵 侯晓磊 张海宁

多烯紫杉醇是一种微管蛋白结合药物，抗瘤谱广，主要作用于卵巢癌、肺癌及乳腺癌等[1-3]，吉西他滨是一种二氟核苷酸类抗代谢药物，主要破坏细胞的复制功能。在临床使用多烯紫杉醇联合吉西他滨化疗的过程中发现肝损伤的情况，且在动物实验中发现二者联合使用后会导致动物肝脏细胞发生大量变性[4-6]，还可诱导脂质氧化造成细胞膜的损害[7-8]，但其机制研究尚不明确。

资料与方法

一、实验动物

雄性ICR小鼠体质量18～20 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，按照SPF级动物饲养标准进行饲养。

二、药品及试剂

多烯紫杉醇及吉西他滨购于深圳万乐制药公司，批号分别为：2009041，20091001；ALT、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、丙二醛定量试剂盒采购于南京建成生物公司。

三、仪器

恒温水浴锅购于金坛医疗仪器公司，Baujahr低温离心机购于上海博星公司，8430紫外-可见分光光度计购于惠普公司。

四、分组及给药

将40只小鼠随机分为四组：正常对照组、低剂量给药组、中剂量给药组及高剂量给药组，静脉连续注射5 d后对各项指标进行检测，正常对照组采用等剂量的生理盐水注射。

五、生化指标的检测

研究在不同射击工况下的弹丸膛内运动规律，对弹丸装药的设计和弹炮匹配性设计具有一定的指导意义，未来将对不同磨损程度的身管内弹丸运动规律作进一步的研究。

小鼠采用眼眶取血，取血后经3 000 r/min离心10 min，分离血清检测ALT。取肝组织0.2 g，用生理盐水制成组织匀浆，用于测定超氧化物歧化酶、丙二醛及谷胱甘肽，另取0.3 g肝组织制备线粒体，将肝组织匀浆，采用梯度离心法提取线粒体并用考马斯亮蓝检测线粒体蛋白浓度。

六、线粒体膜电位测定

使用RH123标记线粒体膜电位，测定膜电位值，在25 ℃条件下，将线粒体提取液与0.3 μmol/L的RH123共同孵育3 min，用测定液细两次后，离心重悬，用荧光分光光度计测定线粒体悬液的荧光强度，荧光越弱表明膜电位值越低。

七、线粒体肿胀程度的检测

线粒体的肿胀程度测定主要根据线粒体悬液在波长540 nm处的D值进行判定。将制备的肝脏线粒体按照0.5 mg/mL重悬于线粒体缓冲液，在30 ℃的条件下，加入50 μmol/L的钙离子，每隔2 min测定一次D值的降低，测定5次，D值越大表明线粒体肿胀程度越大。

八、统计学方法

所有数据采用SAS 9.4进行分析。组间差异的检测采用SNK-Q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

多烯紫杉醇联合吉西他滨处理的小鼠，血清ALT含量较对照组小鼠有显著升高，对照组为(35.41±3.79)U/L, 低剂量组为 (52.79±4.13)U/L，中剂量组为(72.43±5.23)U/L，高剂量组为(102.95±5.73)U/L，给药组与对照组差异具有统计学意义(P<0.05)，且随着多烯紫杉醇联合吉西他滨用药量的增加其ALT含量呈上升趋势。

二、多烯紫杉醇联合吉西他滨能够诱导小鼠肝脏的氧化功能受损

与正常对照组小鼠相比，多烯紫杉醇联合吉西他滨的小鼠肝组织中丙二醛的含量明显增高，且随着给药量的增加，丙二醛的增高更明显，同时给药组小鼠的谷胱甘肽及超氧化物歧化酶较对照组小鼠呈显著降低趋势，该趋势不随药量的增加而增加。见表1。

三、多烯紫杉醇联合吉西他滨对小鼠肝脏线粒体膜电位的影响

经过多烯紫杉醇联合吉西他滨处理后小鼠的RH123荧光强度较正常对照组小鼠的23.13分别降低到20.38、18.13和14.25，随着给药剂量的增大，线粒体的膜电位呈现下降的趋势。

表1 不同给药量对小鼠氧化功能的影响

注：与对照组相比，*P<0.05；与低剂量组相比，#P<0.05；与中剂量组相比，&P<0.05

四、多烯紫杉醇联合吉西他滨对小鼠肝脏线粒体肿胀程度的影响

由图1可以看出，在波长为540 nm处，对线粒体悬液D值的分次检测可以发现，50 μmol/L的钙离子可以诱导正常的线粒体发生细胞肿胀，第5次的D值下降值为0.435，用药组小鼠的第5次D值下降分别为0.725、0.873和0.791，其D值下降程度与给药剂量无相关性。

图1多烯紫杉醇联合吉西他滨对50 μmol/L钙离子诱导的线粒体肿胀的影响

讨 论

多烯紫杉醇联合吉西他滨是一个被广泛应用的化疗方案，而该项化疗方案的应用同时也对肝脏造成了一定损害，目前有研究表明，在大鼠静脉注射多烯紫杉醇3周后出现肝细胞变性，丙二醛升高，还原性谷胱甘肽及超氧化物歧化酶减少[9-10]。

本研究结果显示，在对小鼠进行多烯紫杉醇联合吉西他滨处理后，丙二醛含量升高且超氧化物歧化酶及还原型谷胱甘肽含量下降，表明多烯紫杉醇联合吉西他滨对肝损伤可能与氧化应激有一定相关性，即氧化与抗氧化平衡被破坏，超氧化物歧化酶及还原型谷胱甘肽属于抗氧化防御体系的重要组成部分，二者的降低表明抗氧化防御体系功能的缺失，进而导致胞内活性氧增加，引发脂质过氧化反应，而表现出丙二醛的增多，最终导致肝细胞坏死，肝功能下降。在对线粒体膜电位进行检测时发现，随着给药剂量的增大，线粒体膜电位呈下降趋势，经过药物处理后线粒体的肿胀程度明显增加，推测多烯紫杉醇联合吉西他滨能够影响线粒体膜电位，导致线粒体结构功能发生变化，从而导致肝细胞的氧化、抗氧化平衡破坏，最终导致肝细胞发生坏死，肝功能受损。