望永鼎 刘文华 翟一飞 张 涛

(商丘医学高等专科学校外科，商丘 476000)

结肠癌是发生在结肠部位的消化道恶性肿瘤，发病率已经是恶性肿瘤的第3位，死亡率已达第4位，并且其发病率和死亡率还呈逐年上升的趋势，因此有必要寻找新的治疗药物[1]。防己诺林碱(Fangchinoline，FAN)是防己科防己干燥根中生物碱的主要提取物，其是一种结构复杂的双苄基异喹啉类生物碱，具有抗炎镇痛、利尿消肿和抑制肿瘤等作用[2]。防己诺林碱可以通过多种信号通路来抑制多种肿瘤的发展：防己诺林碱通过抑制Akt和Akt介导的信号级联反应的激酶活性来抑制人胶质母细胞瘤细胞的生长和侵袭[3]；防己诺林碱通过抑制FAK的磷酸化来抑制黑色素瘤细胞的生长和转移[4]；防己诺林碱通过抑制PI3K和下游信号通路抑制人骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和肿瘤发生等[5]。但是防己诺林碱对结肠癌作用并不清楚。低氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)是一种异源二聚体转录因子，主要作为细胞氧平衡和缺氧诱导基因表达的中心调节子；血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)能够促进肿瘤新血管的生成和通透性的增加，是HIF-1α的靶基因之一；蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt)是一种重要的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，执行血管生成，细胞代谢等各种细胞功能[6-9]。本文主要研究防己诺林碱对结肠癌的作用以及与HIF-1α/VEGF/Akt通路的相关性。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 PRMI1640细胞培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购于深圳市伟通生物科技有限公司；BCA试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；Transwell小室购自美国 Corning 公司；Ki67、 PCNA、 E-cadherin、N-cadherin、 HIF-1α、VEGF、 Akt单克隆一抗和二抗均购自英国Abcam公司；免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.1.2仪器 MD全自动显微镜购自美国Molecu-lar Devices公司；超净工作台购自苏州净化设备厂。

1.1.3细胞 结肠癌细胞HT-29购自上海赛默生物科技发展有限公司；

1.1.4动物 40只裸鼠购自河南省医疗器械，许可证：SYXK(豫)2017-0010。

1.2方法

1.2.1细胞培养 HT-29细胞培养于PRMI1640细胞培养基(含 10% FBS、1% 青霉素、1% 链霉素)中，在37℃、CO25%、饱和湿度90%的恒温箱中培养到贴壁生长到 80%，便可消化传代培养。

1.2.2实验分组及处理 设置Blank cells 组，FAN(5 μg/ml)组、FAN(10 μg/ml)组和FAN(20 μg/ml)组；Blank cells 组HT-29细胞正常培养；FAN(5 μg/ml)组、FAN(10 μg/ml)组和FAN(20 μg/ml)组HT-29细胞分别用5、10、20 μg/ml FAN处理48 h。

1.2.3克隆形成实验 将HT-29细胞介入6孔板，约3×102个/孔。贴壁后分别加入含有5、10和20 μg/ml FAN的培养基孵育，2 d更换更换一次培养液。15 d后，弃去培养基，用4% 的多聚甲醛固定细胞，然后用结晶紫染色。拍照并计算克隆形成率：克隆形成率(%)=细胞克隆数均值/铺板细胞总数×100%。

1.2.4Western blot检测 将处理后的细胞冲洗后加入RIPA蛋白裂解液，离心之后取上清，BCA试剂盒检测蛋白浓度。每个样本取30 μg进行SDS-PACE，半干法将蛋白转移到PVDF膜上，室温下用10% 脱脂奶粉封闭1 h；然后加入对应的一抗(Ki67、 PCNA、 E-cadherin、N-cadherin、 HIF-1α、VEGF、 Akt均稀释1∶500，GAPDH为1∶1 000)4℃过夜；接着用磷酸缓冲液冲洗后加入HRP标记的二抗(1∶2 000)，室温下孵育2 h；最后，ECL 显影后扫描，蛋白相对表达量以GAPDH 为内参校正后，经Quantity-One软件分析。

1.2.5Transwell检测 取对数期的HT-29细胞，用胰蛋白酶消化后，离心弃上清，按照不同分组分别加入含有不同浓度FAN的不含有胎牛血清的细胞培养液悬浮细胞(浓度为2×105个/ml)，取200 μl加入上室，在外室加入500 μl含有 10%胎牛血清的细胞培养液。培养 48 h 后，将小室取出，用 90%的乙醇溶液固定；然后用 PBS 洗涤后；接着1%的结晶紫染色；最后，在显微镜下随机选择视野并计算侵袭细胞数目。

1.2.6体内实验 用1 ml注射器吸取配制好的细胞悬液0.2 ml，向小鼠的右侧腋窝皮下注射，在注射局部可触及明显皮丘后迅速退针。接种5 d后，小鼠右腋下可触及直径约5 mm的皮下结节，提示建模成功。将40只造模成功的小鼠随机分为4组，每组10只。每天腹腔注射0、5、10和20 μg/ml FAN 2 ml，培养32 d。检测移植瘤体积：V=(长×宽2)/2；免疫组化检测Ki67和VEGF；Western blot检测HIF-1α、VEGF和Akt的表达。

1.2.7免疫组化检测 将组织用中性甲醛溶液固定后，用石蜡包埋；然后将石蜡包埋的组织块切片；接着石蜡切片脱蜡水化，阻断过氧化物酶，抗原修复，血清封闭分别加入Ki67和VEGF单抗，4℃过夜，加入二抗，加入生物素蛋白工作液，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片；最后在显微镜下观察统计。

1.2.8HE染色 将肾组织和肝组织放置4%甲醛固定后用酒精梯度脱水，然后用石蜡包埋切片。将石蜡切片经过二甲苯脱蜡、酒精覆水、苏木精染色、乙酸分化、返蓝、伊红染色后，脱水固定装片，显微镜下观察。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方面方差分析及t检验，P<0.05，为差异有统计学意义。

2 结果

2.1防己诺林碱对结肠癌细胞HT-29生长的影响 通过克隆形成实验发现：与Blank cells组相比，FAN组的结肠癌细胞HT-29克隆形成率显著降低，说明防己诺林碱抑制结肠癌细胞HT-29的克隆形成(P<0.01，图1A)；随着防己诺林碱浓度的升高，结肠癌细胞HT-29克隆形成率逐渐降低，说明防己诺林碱对结肠癌细胞HT-29克隆形成的抑制作用随着浓度的升高而增强(图1A)。

通过Western blot检测增殖标记蛋白Ki67和PCNA的表达结果显示：与Blank cells组相比，FAN组的结肠癌细胞HT-29Ki67和PCNA的表达量显著下调，说明防己诺林碱抑制结肠癌细胞HT-29的增殖(P<0.01，图1B)；随着防己诺林碱浓度的升高，结肠癌细胞HT-29的Ki67和PCNA表达量逐渐降低，说明防己诺林碱对结肠癌细胞HT-29增殖的抑制作用随着浓度的升高而增强(图1B)。

2.2防己诺林碱对结肠癌细胞HT-29侵袭的影响 通过Transwell检测细胞侵袭情况可知：与Blank cells组相比，FAN组的结肠癌细胞HT-29侵袭细胞数目显著减少，说明防己诺林碱抑制结肠癌细胞HT-29的侵袭能力(P<0.01，图2)；随着防己诺林碱浓度的升高，结肠癌细胞HT-29侵袭细胞数目逐渐减少，说明防己诺林碱对结肠癌细胞HT-29侵袭能力的抑制作用随着浓度的升高而增强(图2)。

2.3防己诺林碱对结肠癌细胞HT-29 上皮-间质转化的影响 通过Western blot检测VEGF、E-cadherin和 N-cadherin的表达发现：与Blank cells组相比，FAN组的结肠癌细胞HT-29的VEGF和N-cadherin表达量显著下调，E-cadherin表达量显著上调，说明防己诺林碱抑制结肠癌细胞HT-29上皮-间质转化(P<0.01，图3A)；随着防己诺林碱浓度的升高，结肠癌细胞HT-29的VEGF和N-cadherin表达量逐渐降低，E-cadherin表达量逐渐上调，说明防己诺林碱对结肠癌细胞HT-29上皮-间质转化的抑制作用随着浓度的升高而增强(图3A)。通过显微镜观察发现：与Blank cells组相比，FAN组的结肠癌细胞HT-29的排列紧密，说明防己诺林碱抑制结肠癌细胞HT-29上皮-间质转化；随着防己诺林碱浓度的升高，结肠癌细胞HT-29的排列逐渐变得紧密，说明防己诺林碱对结肠癌细胞HT-29上皮-间质转化的抑制作用随着浓度的升高而增强(图3B)。这与Western blot检测VEGF、E-cadherin和 N-cadherin的表达结果相一致。

图1 防己诺林碱对结肠癌细胞HT-29生长的影响Fig.1 Effect of feninoline on growth of colon cancer cell line HT-29Note:A.Cell growth was detected by a colony formation assay;B.Ki67 and PCNA expression was detected by Western blot;**.P<0.01 versus Blank cells group.

图2 Transwell检测细胞侵袭情况(40倍)Fig.2 Detection of cell invasion by Transwell(40 times)Note:**.P<0.01 versus Blank cells group.

2.4防己诺林碱对结肠癌细胞HT-29的作用通路 通过Western blot检测HIF-1α、VEGF和Akt的表达结果可知：与Blank cells组相比，FAN组的结肠癌细胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表达量显著下调，说明防己诺林碱抑制结肠癌细胞HIF-1α、VEGF/Akt信号通路的激活(P<0.01，图4)；随着防己诺林碱浓度的升高，结肠癌细胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表达量逐渐降低，说明防己诺林碱对结肠癌细胞HT-29HIF-1α/VEGF/Akt信号通路激活的抑制作用随着浓度的升高而增强(图4)。

2.5防己诺林碱在体内对结肠癌细胞HT-29的影响 通过移植瘤体积测定发现：所有组的移植瘤体积随着天数增多在不断变大，但是FAN组的移植瘤体积与Blank组相比整体较小，说明防己诺林碱抑制结肠癌细胞在体内的生长(图5A、B)。通过免疫组化检测Ki67和VEGF发现：与Blank组相比，FAN组的结肠癌细胞Ki67和VEGF阳性细胞所占百分比显著减少，说明防己诺林碱抑制结肠癌细胞HT-29的增殖(P<0.01，图5C)；随着防己诺林碱浓度的升高，结肠癌细胞HT-29的Ki67和VEGF阳性细胞所占百分比逐渐减少，说明防己诺林碱对结肠癌细胞HT-29增殖的抑制作用随着浓度的升高而增强(图5C)。这与体外实验结果相一致。通过Western blot检测HIF-1α、VEGF、Akt的表达结果发现：与Blank组相比，FAN组的结肠癌细胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表达量显著下调，说明防己诺林碱抑制结肠癌细胞HIF-1α/VEGF/Akt信号通路的激活(P<0.01，图5D)；随着防己诺林碱浓度的升高，结肠癌细胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表达量逐渐降低，说明防己诺林碱对结肠癌细胞HT-29HIF-1α/VEGF/Akt信号通路激活的抑制作用随着浓度的升高而增强(图5D)。这和体外实验检测结果完全一致。通过HE染色可知，Blank组大鼠的肝肾组织均结构完整清晰，细胞界限分明，无肿胀、系膜增生、充血、炎症细胞浸润等病理特征，与Blank组相比，FAN组肝肾组织无明显变化，说明该剂量的防己诺林碱对肝、肾无损伤，可以安全应用(图5E)。

图3 上皮-间质转化情况Fig.3 Epithelial-mesenchymal transitionNote:A.The expression of VEGF,E-cadherin and N-cadherin was detected by Western blot;B.The morphology of epithelial to mesenchymal transition was observed by microscope;**.P<0.01 versus Blank cells group.

图4 Western blot检测HIF-1α、VEGF、Akt的表达Fig.4 Detection of HIF-1α,VEGF,Akt expression by Western blotNote:**.P<0.01 versus Blank cells group.

图5 防己诺林碱在体内对结肠癌细胞HT-29的影响Fig.5 Effect of hexinoline on colon cancer cell line HT-29 in vivoNote:A.Tumor status of different groups;B.Tumor volume of different groups;C.Detection of Ki67 and VEGF by immunohistochemistry (400 times);D.Detection of expression of HIF-1α,VEGF,Akt by Western blot;E.Liver and kidney damage were observed by HE staining;**.P<0.01 versus Blank group.

3 讨论

细胞的恶性生长增殖是肿瘤形成的重要原因，抑制肿瘤细胞的恶性生长增殖是抑制肿瘤发展的关键，如，Yao等[10]发现山奈酚通过抑制食管鳞状细胞癌细胞增殖来抑制食管鳞状细胞癌发展。防己诺林碱可抑制乳腺腺癌、肺癌等肿瘤细胞的增殖[11]。同样，本研究发现防己诺林碱抑制结肠癌细胞HT-29的克隆形成。并且发现，防己诺林碱显著下调结肠癌中Ki67和PCNA的表达量。Ki67和PCNA是众所周知的评估细胞增殖的标记物。这进一步证明防己诺林碱可以抑制结肠癌细胞HT-29的增殖。

结肠癌在确诊时通常伴有局部和远处的侵袭转移，且肿瘤术后复发转移是导致结肠癌患者死亡的主要原因，所以，检测药物对结肠癌细胞的侵袭能力影响是治疗结肠癌的关键[12]。Tian等[13]研究发现防己诺林碱靶向P13抑制胃癌细胞SGC7901的增殖和侵袭，推测防己诺林碱具有抑制结肠癌细胞侵袭的能力。本研究发现，防己诺林碱明显减少结肠癌细胞侵袭数目，证明防己诺林碱对结肠癌细胞HT-29的侵袭能力具有抑制作用。

上皮间质转化是以得到间充质干细胞特性、丧失上皮细胞特性为主要特征的生理病理现象，是肿瘤细胞发生侵袭转移的重要证据[14]。如，Dinicola等[15]报道尼古丁通过上皮向间质转化增加结肠癌细胞的迁移和侵袭。虽未有研究报道防己诺林碱对肿瘤细胞上皮间质转化的影响，但本研究结果发现防己诺林碱显著下调结肠癌细胞HT-29的VEGF和N-cadherin表达量、上调E-cadherin表达量，说明防己诺林碱抑制结肠癌细胞HT-29上皮-间质转化。

HIF-1α/VEGF/Akt信号通路和癌症的发展息息相关，如，He等[16]报道没食子酸通过PTEN/HIF-1α/VEGF/Akt信号通路抑制卵巢癌发展，Lee等[17]发现京尼平通过抑制HIF-1α积累和VEGF表达抑制结肠癌细胞的侵袭和迁移，从而抑制结肠癌。已有研究发现防己诺林碱通过Akt/GSK-3beta/cyclin D1信号通路抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[18]。本研究发现防己诺林碱显著下调结肠癌细胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表达量，说明防己诺林碱抑制结肠癌细胞HIF-1α/VEGF/Akt信号通路。

在体外实验时，我们已经发现防己诺林碱可以抑制结肠癌细胞HT-29的生长和增殖、侵袭能力、上皮-间质转化，并且抑制结肠癌细胞HIF-1α/VEGF/Akt信号通路，从而抑制结肠癌的发生和发展。为了取得更好的证据，进行了裸鼠体内实验。结肠癌体内实验模型通常是采用皮下注射构建模型[19]，本文也采用此方法构建了结肠癌移植瘤模型。通过肿瘤体积测定发现，给防己诺林碱的裸鼠的肿瘤体积显著较小，这说明防己诺林碱抑制结肠癌细胞在体内的生长。通过免疫组化检测Ki67和VEGF发现，防己诺林碱显著降低结肠癌细胞HT-29 Ki67和VEGF阳性比率，说明防己诺林碱抑制结肠癌细胞HT-29的增殖。通过Western blot检测HIF-1α、VEGF、Akt的表达结果发现，防己诺林碱显著下调结肠癌细胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表达量，说明防己诺林碱抑制结肠癌细胞HIF-1α/VEGF/Akt信号通路。这些结果与体外实验结果一致。众所周知，防己诺林碱大剂量或长期使用就会对肝肾有一定毒性，其中以肝损害为重，且损害程度与药物剂量有一定正比关系，但我们通过HE染色实验发现该剂量药物对肝肾并无损害。

综上所述，防己诺林碱无论是在体内还是体外都可以抑制结肠癌细胞HT-29的生长和增殖、侵袭能力、上皮间质转化，并且抑制结肠癌细胞HIF-1α/VEGF/Akt信号通路，从而抑制结肠癌的发生和发展。这为防己诺林碱开发了新的应用市场，同时也为结肠癌的治疗提供新的参考数据。