孙红婷 宋艳荣

(沈阳医学院附属中心医院神经内科，沈阳 110024)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其临床症状主要是认知和记忆功能障碍，同时伴有精神和行为障碍。AD的病理特征包括β-淀粉样蛋白(Aβ)异常沉积、tau蛋白过度磷酸化形成的神经元纤维缠结、突触神经元丢失、氧化应激及神经炎症等[1]。在过去的几年中，上市的治疗药物只能缓解症状，并不能从根本上延缓AD的发病进程。因此，寻求新的AD治疗药物及靶点已经成为全世界医学专家亟待解决的问题[2]。

从中国传统医学角度看，AD发病的根本原因是肾精亏虚，髓海不足。中医学认为“肾主智，肾虚则智不足”，“肾藏精，主骨生髓”，“脑为髓之海”，脑髓的充养与肾精的充盈密切相关，同时AD是与髓减脑消关系最为密切的疾病之一，因此大多中医学者多以补肾填精、益气养血等作为治疗AD的基本法则[3]。楮实子(Fructus broussonetiae,FB)味甘性寒，归肝肾经，功效为补肾清肝，明目，利尿；主治肝肾不足，腰膝酸软，虚劳骨蒸，头晕目昏[4]。有研究表明，楮实子能通过促进APP/PS1小鼠海马神经发生发挥神经保护作用[5]。此外，楮实子提取物能够通过调节p38-MAPK信号通路活性来改善D-半乳糖所致的PC12细胞凋亡[6]。但是对Aβ沉积及学习记忆能力的改善及其作用机制尚未见报道。

cAMP反应序列结合蛋白(cAMP responsive element binding protein,CREB)是一种重要的核转录因子，能够调节启动子中含有环磷酸腺苷反应原件(CRE)的基因转录，CREB在神经发生、突触形成及改善学习记忆能力方面具有重要的调节作用[7]。磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(Protein-serine-threonine kinase,Akt)信号通路与细胞生长、增殖、迁移及凋亡等过程均密切相关。PI3K磷酸化后被激活，可正性调节CREB，使其磷酸化并连接到相应的启动子区，诱导cAMP反应原件基因表达[8]。因此，本研究探讨楮实子提取物对APP/PS1小鼠海马区Aβ沉积、学习记忆能力及对PI3K-CREB-XBP1信号通路活性的影响，为治疗AD等神经退行性疾病开发新药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与试剂 SPF级C57BL/6雄性小鼠，购于辽宁长生生物有限公司[SCXK(辽)：2013-0001]，7月龄APP/PS1双转基因AD小鼠购自北京中科泽晟生物技术有限公司[SCXK(京)2013-0001]，体重(20±2)g，楮实子购自安徽亳州药材市场，盐酸多奈哌齐(Sigma公司)，鼠来源Aβ1-42抗体(Santa Cruze公司)，鼠来源Iba-1抗体(Abcam公司)，兔来源GFAP及GAPDH抗体(北京博奥森)，兔BACE1、ADAM10、PI3K、p-PI3K、CREB、p-CREB、XBP1s及XBP1u抗体购于CST公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔二抗购于北京中杉金桥科技有限公司，羊抗小鼠FITC标记二抗、驴抗兔Cy3标记二抗(Jackson公司)，全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒(北京碧云天公司)，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2仪器 石蜡切片机(德国莱卡公司)，荧光倒置显微镜、照相系统(日本尼康公司)，MS-1水迷宫仪(成都仪器厂)，酶标仪(深圳迈瑞公司)，半干式蛋白转膜仪(Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1实验动物分组 将7月龄APP/PS1双转基因小鼠随机模型组(model)、楮实子低剂量组(2 g/kg,FB-L)、楮实子高剂量组(4 g/kg,FB-H)和阳性药组(10 mg/kg盐酸多奈哌齐,DH)，每组10只；另取10只同龄的C57BL/6小鼠作为对照组(control)。

1.2.2药材准备 取适量楮实子药材，置于10倍量蒸馏水中浸泡2 h后进行煎煮，共2次，每次2 h，回收药液并合并，浓缩药液至生药浓度为1 g/ml，对小鼠进行灌胃给药，阳性药组用10 mg/kg多奈哌齐灌胃给药，对照组给予同体积的蒸馏水，连续治疗8周。最后一次给药1 h后处死小鼠，取脑、一部分脑组织包埋，制备石蜡切片，另一部分置于-80℃冰箱保存，用于Western blot检测。

1.2.3水迷宫实验 各组小鼠治疗7周后，Morris水迷宫用于评估小鼠的学习和记忆能力。该装置由一个圆形池(直径120 cm，高60 cm)和黑色内壁组成，黑色内壁细分为四个相等的象限，并用水(25℃)填充至30 cm的深度。将逃逸平台(直径10 cm)放置在其中一个象限内并浸没在水面下约1 cm 处。连续5 d分别从四个象限中观察小鼠的逃避潜伏期。如果小鼠在60 s内无法到达平台，则将它们引导至平台并停留10 s。训练5 d后，移除平台并进行空间探索实验，将各组小鼠从同一入水点放入水中，观察其穿越原平台的次数以及在原平台所在象限停留的时间。

1.2.4免疫荧光染色 脑组织制备石蜡切片，厚为5 μm，组织切片常规脱蜡之后，将组织切片放入枸橼酸缓冲溶液中，利用微波法进行抗原修复，微波炉加热沸腾5 min×3次；滴加3 % H2O2溶液5 min，阻断内源性过氧化物酶；分别加入GFAP、Iba-1或Aβ1-42一抗(1∶300)，4℃孵育过夜，次日加入羊抗小鼠FITC标记二抗或驴抗兔Cy3标记二抗(1∶500)室温避光孵育1 h；DAPI染核15 min，盖玻片封片，置于荧光显微镜下观察阳性细胞表达情况。

1.2.5Western blot 剥离各组小鼠海马组织，置于RIPA裂解液中研磨，提取总蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，分别进行电泳、转膜及显色后，凝胶成像分析系统扫描，测定光密度。Aβ1-42、BACE1、ADAM10、PI3K、p-PI3K、CREB、p-CREB、XBP1s、XBP1u及GAPDH抗体稀释浓度均为1∶1 000，HRP标记二抗稀释浓度为1∶1 000。采用目的条带与内参蛋白条带光密度比值作为结果进行统计分析。

2 结果

2.1楮实子提取物对APP/PS1小鼠的学习与记忆能力的影响 Morris水迷宫结果如图1所示，逃避潜伏期结果(图1A、B)显示，经过5 d的定位航行训练，对照组逃避潜伏期最短，与对照组相比，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长，差异具有统计学意义(P<0.05)；楮实子低、高剂量及阳性药组小鼠的逃避潜伏期显著缩短，与模型组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；楮实子高剂量与阳性药组相比，差异不具有统计学意义(P>0.05)。空间探索实验结果(图1C、D)显示，与对照组相比，模型组小鼠在原平台目标象限停留时间显著缩短、穿越原平台次数明显减少(P<0.05)，楮实子低、高剂量及阳性药组小鼠在原平台目标象限停留时间及穿越平台次数显著增加，与模型组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，且楮实子低剂量与阳性药组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1 FB对APP/PS1小鼠学习和记忆的影响Fig.1 Effect of FB on learning and memory in APP/PS1 miceNote:A.The escape latency in the formal experiments of the water maze task;B.Target quadrant residence time;C.The number of times the platform location was crossed.#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs model group;&.P<0.05 vs DH group.

2.2楮实子对星形胶质细胞及小胶质细胞异常活化的影响 楮实子对星形胶质细胞及小胶质细胞异常活化的影响结果如图2所示，对照组小鼠海马区GFAP及Iba-1阳性细胞表达较少；模型组小鼠海马区GFAP及Iba-1阳性表达明显增加，与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，楮实子低、高剂量及阳性药组小鼠海马区GFAP及Iba-1阳性表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；且楮实子高剂量与阳性药组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 FB对APP/PS1小鼠海马中GFAP和Iba-1表达的影响(×200)Fig.2 Effect of FB on expression of GFAP and Iba-1 in hippocampal of APP/PS1 mice(×200)Note:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs model group;&.P<0.05 vs FB-L group.

图3 FB对APP/PS1小鼠海马中Aβ1-42沉积的影响Fig.3 Effect of FB on Aβ1-42 deposition in hippocampal of APP/PS1 miceNote:A.Representative images of Aβ plaque by immunofluorescence staining (×200)；B.The representative bands of proteins of Aβ1-42.#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs model group.

图4 FB对APP/PS1小鼠海马中ADAM10和BACE1蛋白表达的影响Fig.4 Effect of FB on ADAM10 and BACE1 protein expression in hippocampal of APP/PS1 miceNote:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs model group.

2.3楮实子对Aβ1-42斑块沉积的影响 免疫荧光结果(图3A)显示，对照组小鼠海马区未见Aβ1-42斑块沉积，而模型组小鼠海马区可见大量的Aβ1-42斑块沉积，与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；楮实子低、高剂量及阳性药物治疗后，小鼠海马区Aβ1-42沉积明显减少，与模型组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。为了进一步验证楮实子对Aβ1-42沉积的影响，利用Western blot检测了小鼠海马区Aβ1-42蛋白表达情况，结果发现楮实子低、高剂量及阳性药组Aβ1-42蛋白表达明显降低，与模型组相比，差异具有统计学意义(P<0.05,图3B)，与免疫荧光结果一致。

2.4楮实子对ADAM10及BACE1蛋白表达 结果如图4所示，对照组小鼠ADAM10蛋白高表达，而BACE1蛋白低表达；模型组小鼠海马组织ADAM10蛋白水平明显降低，而BACE1蛋白水平显著升高，与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；楮实子低、高剂量及阳性药组ADAM10蛋白水平明显增加，而BACE1蛋白水平显著降低，与模型组相比，差异无统计学意义(P<0.05)；且楮实子高剂量与阳性药组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5楮实子对PI3K-CREB-XBP1信号通路相关蛋白表达的影响 结果如图5所示，与对照组相比，模型组小鼠海马区p-PI3K/PI3K、p-CREB/CREB及XBP1s/XBP1u蛋白比值明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)； 而楮实子低、高剂量及阳性药物能够明显提高p-PI3K/PI3K、p-CREB/CREB及XBP1s/XBP1u蛋白比值，与模型组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；且楮实子高剂量与阳性药组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

图5 FB对APP/PS1小鼠海马中p-PI3K，PI3K，p-CREB，CREB，XBP1s和XBP1u蛋白表达的影响Fig.5 Effect of FB on p-PI3K,PI3K,p-CREB,CREB,XBP1s and XBP1u proteins expression in hippocampal of APP/PS1 miceNote:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs model group.

3 讨论

AD是全世界老龄化人群中最常见的中枢神经系统退行性疾病之一。神经元外Aβ沉积形成的老年斑和由于tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结是其两大病理学特征，其中Aβ级联假说是研究最为广泛的[9]。Aβ沉积后具有神经毒性，能与脑内受体酪氨酸激酶EphB2、晚期糖化终产物受体RAGE等多种细胞表面分子结合，激活细胞间的信号传递，进而引起细胞氧化应激、细胞内钙紊乱、线粒体功能障碍、抑制海马神经元长时程增强、诱导神经元凋亡，参与了AD的病理形成，最终导致记忆减退、认知障碍和人格改变[10]。

《日华子本草》 中记载：楮实子具有“壮筋骨、助阳气、补虚劳、助腰膝、益颜色”之功效。 现代药理学研究表明楮实子提取液具有改善学习记忆能力、增强免疫力、降血脂、抗氧化及抗肿瘤等作用。楮实子化学成分复杂，主要化学成分包括总皂苷、黄酮、生物碱、脂肪油、红色素、多糖以及多种人体必需且具有重要药理活性的微量元素和氨基酸等。其中，总皂苷是楮实子药理活性的中药成分之一[11]。楮实子水提液能明显改善老年小鼠的学习与记忆能力，可明显缩短小鼠走迷宫取食时间及减少错误次数；还能够通过抑制小鼠海马区内质网应激水平来改善AD模型小鼠的学习与记忆能力。楮实子提取物还能够提高脑内超氧化物歧化酶活性降低AD模型氧化应激水平，从而改善脑内微环境[12]。并且何堃等[4]利用网络药理学筛选的方法从楮实子中筛选出60个化合物，如棕榈酸、油酸、8，11-十八碳二烯酸等;还有黄酮类如木犀草素、芹菜素;还有香豆素类如东莨菪素、香豆酸以及δ-生育酚等。这些活性成分可与AD有关的27个潜在靶点存在较强的联系，以及4条相关信号通路，包括细胞凋亡、能量代谢、钙信号通路、肿瘤坏死因子(TNF) 信号通路、胰岛素抵抗等[13]。以上研究说明楮实子具有多靶点、多途径、多层次治疗AD的特点。

APP/PS1转基因小鼠模型目前是世界上公认的AD动物模型之一，可表达突变的人类早老素基因(第九个外显子突变)和人鼠淀粉样前体蛋白融合体，其中人类早老素基因的第九个外显子突变缺失是导致早发性老年痴呆症发生的关键原因[14]。大脑海马区是AD患者中枢神经系统最易受到损害的区域之一，负责学习和记忆功能的维持。由于AD患者海马神经元外可沉积大量老年斑及神经纤维缠结，因此AD患者在患病早期即会出现学习与记忆障碍[15]。Morris水迷宫是一种评价空间辨别性学习记忆能力的实验手段，是评价啮齿类动物空间学习记忆功能的经典方法[16]。本研究结果发现，给予楮实子提取物连续治疗8周后小鼠逃避潜伏期缩短，表明获取空间信息记忆的能力有所改善；同时小鼠穿越原平台次数增多，原平台象限停留时间延长，表明楮实子提取物改善了APP/PS1小鼠对获取的空间信息的记忆储存及再现能力。

Aβ的大量沉积可活化星形胶质细胞和小胶质细胞，释放炎症介质，产生大量炎症因子及其他神经毒性物质，从而造成神经元损伤[17]。GFAP和Iba-1分别为星形胶质细胞和小胶质细胞的特异性蛋白，其阳性细胞表达增多即可反映出星形胶质细胞和小胶质细胞活化程度[18]。本研究利用免疫荧光染色法检测小鼠海马GFAP和Iba-1的表达情况，结果显示，楮实子提取物能够明显减少小鼠海马GFAP和Iba-1的阳性细胞数量，说明楮实子可以抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的异常活化，减轻APP/PS1小鼠神经损伤。同时，免疫荧光染色及Western blot结果显示楮实子低、高剂量组APP/PS1小鼠脑内海马区Aβ1-42沉积明显改善，说明楮实子改善小鼠学习与记忆能力，并抑制星形胶质细胞和小胶质细胞活化与改善神经元外Aβ1-42沉积有关。

机体存在两种淀粉样前体蛋白APP(Amyloid precursor protein,APP)水解途径，分别为淀粉样水解途径和非淀粉样水解途径。其中，非淀粉样水解途径是APP经α分泌酶(ADAM10)酶切后形成的可溶性Aβ片段，所产生的可溶性Aβ片段不具有神经毒性；而淀粉样水解途径是APP经β分泌酶(BACE1)酶切后形成C99片段，随后再由γ分泌酶进行酶切，生成可溶性的Aβ1-40或不可溶性的Aβ1-42，普遍认为Aβ1-42的异常生成是导致老年斑形成的罪魁祸首[19,20]。本研究为了探讨楮实子对Aβ1-42生成途径相关酶活力的影响，我们检测了α分泌酶(ADAM10)及β分泌酶(BACE1)蛋白表达。结果发现，楮实子提取物能够明显增加ADAM10蛋白表达，而抑制BACE1蛋白表达，说明楮实子能增强APP的非淀粉样水解，而抑制APP的淀粉样水解，从而减少了Aβ1-42的沉积。

CREB具有调节突触可塑性和改善长期记忆能力的作用。有研究表明，在AD模型中，CREB和活性降低，但其可以被PI3K/Akt信号通路所激活，发挥神经保护作用；同时，PI3K磷酸化激活后能促进XBP1剪切生成具有转录活性的蛋白XBP1s，从而使XBP1活性增加；而XBP1是ADAM10的转录因子之一，ADAM10的活性与XBP1成正比[21-23]。有研究表明，XBP1的活性降低是Aβ1-42斑块沉积和AD病情加重的原因之一，因此说明PI3K-CREB-XBP1信号通路在AD发展过程中具有重要作用[24]。我们为了探究楮实子抑制Aβ1-42沉积的作用机制，我们检测了PI3K-CREB-XBP1信号通路相关蛋白PI3K、p-PI3K、CREB、p-CREB、XBP1s及XBP1u蛋白的表达情况没结果发现，楮实子能够明显提高p-PI3K/PI3K、p-CREB/CREB及XBP1s/XBP1u蛋白的表达，提示楮实子抑制Aβ1-42沉积，改善APP/PS1小鼠学习与记忆能力，可能与激活PI3K-CREB-XBP1信号通路有关。

综上所述，楮实子提取物能够改善APP/PS1小鼠改善学习与记忆能力，抑制星形胶质细胞与小胶质细胞活化，抑制Aβ1-42沉积的作用机制可能与调控PI3K-CREB-XBP1信号通路活性有关，但具体作用机制仍需进一步深入研究。