郭简宁 李 萍 赵京霞 底婷婷 张 璐 王 燕

(首都医科大学附属北京中医医院，北京市中医研究所，银屑病中医临床基础研究北京市重点实验室，北京 100010)

银屑病是一种慢性复发性炎症性皮肤疾病，其发病机制尚不明确。研究表明，银屑病也是一种身心疾病，对136例银屑病患者和146例体检健康者的临床研究结果显示：银屑病患者焦虑情绪发生率为89.7%，远高于正常对照组焦虑情绪发生率28.8 %[1]。银屑病患者所伴发的焦虑与抑郁等症状，严重影响患者的生活质量，甚至导致疾病迁延不愈或恶化[2,3]。研究发现，焦虑、抑郁状态可引起中枢神经系统神经递质分泌增加，进而导致皮肤神经纤维在皮损局部分泌更多的神经递质，通过神经免疫调节，放大局部皮损的炎症反应[4]。临床和基础研究均表明，抗焦虑抑郁、干预神经递质对银屑病的治疗具有一定的疗效[5-7]。

绿原酸(Chlorogenic acid)，是一种苯丙素类化合物，它广泛存在于忍冬科忍冬属、菊科蒿属植物中，提取物来源于中药杜仲、金银花、白茅根等，这些中药均为治疗银屑病的常用中药[8]。绿原酸具有广泛的药理作用，除抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎等作用外[9]，其肠道代谢产物有一定抗焦虑抑郁作用[10,11]，然而目前尚未见绿原酸治疗银屑病研究的相关报道。综合以上研究基础，我们推测绿原酸治疗银屑病的可能机制，是否与抗焦虑抑郁、调节神经递质相关，因此本研究通过咪喹莫特诱导建立银屑病样小鼠模型，从改善皮损炎症、调节神经递质SP表达、缓解焦虑的角度，探究绿原酸治疗银屑病的作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 45只雄性BALB/c小鼠，体质量18～20 g，6～8周龄，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物许可证编号SCXK(京)2014-0013。

1.1.2试剂与药物 绿原酸购自美国Sigma-Aldrich公司，甲氨蝶呤片购自上海信谊药厂有限公司，5%咪喹莫特乳膏为四川明欣药业有限责任公司生产，DAB显色液、山羊血清工作液和3%(质量分数)H2O2去氧离子水均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，增殖细胞核抗原PCNA抗体购自美国Abcam公司，Substance P和NK1R单克隆抗体购自美国Affinity公司，Tubulin鼠单抗购自中国北京冠星宇科技有限公司，BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3仪器与设备 高速冷冻离心机(Centrifuge 5415D)由德国Eppendorf公司提供；脱水机(ASP6025)、包埋机(EG1150)、石蜡切片机(RM2255)、烤片机(HI1220)、HE半自动染色仪(AU-TOSTAINER XL)均由德国Leica公司提供。旷场、高架迷宫由上海欣软信息科技有限公司提供，视频分析系统软件为Supermaze。

1.2方法

1.2.1动物造模、分组、给药 参考 van der Fits 等[12]小鼠银屑病样模型制备方法造模。实验前戊巴比妥钠(80 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，背部备皮，面积约2 cm×3 cm，备皮后单笼饲养。依据随机数字表法，将小鼠随机分为空白对照组、模型组、甲氨蝶呤组、绿原酸高、低剂量组，每组9只。各组造模小鼠灌胃治疗2 h后，每日1次，连续6 d，第7天取材。具体造模及给药方法如下：①空白对照组小鼠给予0.9% (质量分数)氯化钠注射液0.2 ml；背部涂抹凡士林乳膏。②模型组小鼠给予0.9% (质量分数)氯化钠注射液0.2 ml；背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg。③甲氨喋呤组小鼠给予1 mg/kg甲氨蝶呤片溶液0.2 ml；造模同模型组。④绿原酸高剂量组小鼠给予等量100 mg/kg药液，低剂量组给予等量50 mg/kg药液；造模同模型组。

1.2.2检测指标及方法

1.2.2.1小鼠银屑病样皮损面积和疾病严重程度评分(PASI评分) 每日对实验小鼠皮损进行拍照，根据PASI评分标准，鳞屑、浸润和红斑按0～4分评价：0分=无；1分=轻微；2分=中度；3分=重度；4分=极严重。每日记录统计分析各组小鼠鳞屑、浸润和红斑分值，将三者分值相加计算总分，绘制PASI评分趋势图，动态观察小鼠皮损的变化情况。

1.2.2.2测量小鼠皮损表皮厚度 造模第7天取材，取一部分小鼠背部皮肤固定于福尔马林中，脱水、包埋后制备5 μm石蜡切片。用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin，HE)染色，通过光学显微镜观察各组小鼠皮肤形态学变化，每个标本选5张不同切片进行拍摄，采用ZEN软件测量表皮厚度。

1.2.2.3免疫组化法检测小鼠表皮层PCNA表达和真皮层CD3阳性T淋巴细胞浸润情况 制备5 μm石蜡切片，免疫组织化学法(Immunohistoche-mistry，IHC)检测PNCA、CD3的表达。在400倍镜下，每例标本随机选取5个视野并拍照，运用IPP 6.0图像分析软件记录阳性细胞数量。

1.2.2.4旷场实验 造模第5天进行旷场实验。该仪器由50 cm×50 cm×50 cm的隔板箱组成，旷场上方安装摄像头，连接电脑，利用Supermaze软件将旷场划分25宫格，具体分为中央区和四边区两个测量区域。实验前，提前将待测小鼠放入临时笼盒适应，减少小鼠紧张；实验开始将小鼠放置于旷场中央区，记录5 min内小鼠的活动情况，包括中央区运动路程、中央区停留时间和中央区进入频率。在每只小鼠测量间隙，用75%酒精清洁旷场内尿液、粪便，防止其他小鼠留下的气味影响实验。

1.2.2.5高架十字迷宫 造模第6天进行高架十字迷宫实验。该仪器由两条开放臂(50 cm长×10 cm 宽)、两条闭合臂(50 cm长×10 cm宽×40 cm高)及中央区(10 cm长×10 cm宽)组成，开臂与闭臂相互垂直“十”字交叉。高架十字迷宫上方安装摄像头，连接电脑，利用Supermaze软件将实验区域划分为中央区、开臂和闭臂区域；具体操作同矿场实验，将小鼠放入中央区且面对开臂，记录5 min内小鼠的活动情况，包括进入开臂次数(Open arm entry，OE)，开臂时间(Open arm time，OT)，闭臂次数(Close arm entry，CE)，闭臂时间(Close arm time，CT)；根据上述指标分别计算出：进入开臂次数比例(OE%):OE/(OE+CE)×100%，开臂停留时间比例(OT%):OT/(OT+CT)×100%。

1.2.2.6Western blot法检测皮损组织中SP、NK-1R蛋白表达 各组小鼠皮损组织加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，电动匀浆机匀浆后，冰上裂解20 min，12 000 r/min 4℃离心5 min，分装保存上清液。BCA法进行蛋白定量。蛋白样品电泳后湿转膜，5%脱脂牛奶封闭，室温轻摇60 min，加入一抗，4℃过夜。洗膜后二抗孵育1 h，再次洗膜，胶片曝光，显影、定影。曝光后的胶片直接扫描，软件Image J读取条带的IOD值。

2 结果

2.1绿原酸对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损的影响 每日观察各组小鼠皮损变化，空白对照组小鼠皮肤始终白嫩，无鳞屑、红斑和浸润皮损；模型组小鼠从第2天开始，皮肤出现轻微红斑和浸润，其背部皮损，随造模时间的推移不断加重，第7天皮损最严重，皮损干燥，鳞屑肥厚，表皮红肿，浸润明显；甲氨喋呤组和绿原酸各剂量组与模型组同期相比，鳞屑、红斑和浸润减轻，其中甲氨喋呤组与绿原酸低剂量组小鼠皮损改善最为明显，见图1。

每日评价记录PASI评分，绘制趋势图，空白对照组小鼠背部皮肤正常无明显改变，其鳞屑、红斑、浸润和总分分值始终为0；其余各组小鼠造模第2天出现轻微皮损，其鳞屑、浸润、红斑和总分分值，随造模时间推移，不同程度的升高，于第7天达到峰值；模型组小鼠与空白对照组相比，其鳞屑、浸润、红斑和总分分值显著升高(P<0.001)；甲氨喋呤组和绿原酸低剂量组与模型组相比，鳞屑、浸润、红斑和总分分值显著降低(P<0.05)；绿原酸高剂量组与模型组相比，可降低浸润分值(P<0.05)，见图2。

2.2绿原酸对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损组织形态及表皮厚度的影响 HE染色结果显示，空白对照组小鼠皮肤表皮层薄，细胞浸润少；模型组小鼠与空白对照组相比，表皮层明显增厚，角化不全及角化过度较多、炎性细胞浸润严重，角质层可见大量Munro微脓肿；甲氨喋呤组和绿原酸各剂量组小鼠与模型组相比，表皮层均变薄，角化不全和角化过度减少，炎性细胞浸润及Munro微脓肿减轻，见图3。

经测量分析发现，模型组小鼠与空白对照组相比，表皮层厚度显著增厚(P<0.001)；甲氨喋呤组和绿原酸各剂量组表皮厚度均显著低于模型组(P<0.001)，其中绿原酸高剂量组表皮厚度低于甲氨喋呤组(P<0.05)，见图4。

2.3绿原酸对银屑病样小鼠皮损组织中PCNA和CD3+T淋巴细胞表达的影响 PCNA为增殖细胞核抗原，可反映银屑病角质细胞增殖状态[13]。免疫组化法可观察到皮损组织中PCNA阳性细胞被染成棕色。空白对照组小鼠皮肤组织PCNA表达于基底层，呈线性分布；模型组小鼠广泛表达于表皮层，其阳性细胞数量较空白对照组明显增多(P<0.001)；甲氨喋呤组和绿原酸各剂量组PCNA阳性细胞数量均较模型组显著减少(P<0.001)，见图5及表1。

我们可在小鼠皮损真皮层中观察到CD3阳性T淋巴细胞浸润情况，CD3阳性T细胞呈棕色点。空白对照组小鼠真皮层CD3阳性细胞数量少， 模型组与空白对照组相比，小鼠皮损组织中CD3阳性细胞数量显著增多(P<0.001)，甲氨喋呤组和绿原酸各剂量组与模型组相比，CD3阳性细胞数量显著减少(P<0.001),见图6及表1。

图1 各组小鼠第7天时皮损表现Fig.1 Skin lesions of mice in each group on the 7th day

图2 各组小鼠皮损PASI评分趋势图Fig.2 PASI scores of mice skin lesions in each groupNote:Compared with control group,###.P<0.001;compared with model group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

图3 各组小鼠皮肤组织形态学观察(HE染色，×400)Fig.3 Histomorphology observation of mice skin tissue in each group(HE staining,×400)

2.4矿场实验 矿场实验结果显示，中央区路程：模型组小鼠与空白对照组相比， 其中央区路程显著减少(P<0.05)、绿原酸各剂量组与模型组相比，中央区路程有一定升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；中央区时间：模型组小鼠与空白对照组相比，中央区时间显著减少(P<0.05)，绿原酸各剂量组与模型组相比，中央区时间有升高趋势，但没有统计学意义(P>0.05)；进入中央区频率：模型组小鼠与空白对照组相比，进入中央区频率减少，但两组之间无统计学意义(P>0.05)，绿原酸各剂量组小鼠与模型组相比,进入中央区频率有升高趋势，但没有统计学意义(P>0.05)，见图7。

图4 各组小鼠皮损组织表皮厚度比较Fig.4 Epidermal thickness of mice skin lesionsNote:Compared with control group,###.P<0.001;compared with model group,***.P<0.001;compared with MTX group，△.P<0.05.

图5 各组小鼠皮损组织中PCNA表达(×400)Fig.5 Expression of PCNA in mice skin lesions(×400)

图6 各组小鼠皮损组织中CD3阳性T淋巴细胞表达(×400)Fig.6 Expression of CD3 positive T lymphocytes in mice skin lesions(×400)

2.5高架十字迷宫实验 高架十字迷宫实验结果显示，空白对照组小鼠与模型组相比，OT%有一定升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，绿原酸各剂量组与模型组相比，结果同空白组(P>0.05)，见图8。

2.6绿原酸对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损中SP、NK1R蛋白表达的影响 与空白对照组相比，模型组小鼠皮损中NK1R蛋白表达量有增高的趋势；甲氨喋呤组、绿原酸各剂量组与模型组相比，NK1R蛋白表达量均有降低趋势，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组小鼠皮损SP蛋白表达显著高于空白对照组(P< 0.001)，与模型组相比，绿原酸低剂量组可降低皮损SP的表达(P<0.05)，见图9。

GroupsNumber of PCNA Number of CD3 positive cellsControl group31.22±3.298.143±0.96Model group90.89±2.531)33.86±1.641)MTX group58.33±2.712)20.57±1.342)CAL group59.44±6.782)20.08±0.962)CAH group47.56±4.132)18.75±1.232)

Note:Compared with control group,1)P<0.001;compared with model group,2)P<0.001.

图7 各组小鼠行为活动评分比较Fig.7 Behavioral activity scores of mice in each groupNote:Compared with control group,#.P<0.05.

2.7皮损中SP、NK1R蛋白表达与CD3阳性T淋巴细胞浸润情况的相关性分析 SP和NK1R等计量资料均呈正态分布，采用双变量相关分析统计SP、NK1R蛋白相对表达量与CD3阳性T淋巴细胞数量的相关性，皮损SP、NK1R蛋白相对表达量与CD3阳性T淋巴细胞数量皆呈正相关，即SP和NK1R神经递质表达量越高，CD3阳性T淋巴细胞数量越多，小鼠背部皮损炎症浸润越严重，见图10。

图8 各组小鼠OE%和OT%比较分析Fig.8 Analysis of OE% and OT% in each group of miceNote:OE% is the proportion of times to enter the open arm,and OT% is the proportion of time to stay in the open arm.

图9 各组小鼠皮损组织中NK1R、SP蛋白相对表达Fig.9 Relative expressions of NK1R and SP proteins in mice skin lesions of each groupNote:Compared with control group,###.P<0.001;compared with model group,*.P<0.05.

图10 皮损中SP、NK1R蛋白相对表达量与CD3阳性T淋巴细胞数量关系Fig.10 Relationship between relative expression of SP and NK1R proteins in skin lesions and number of CD3 positive T lymphocytes

3 讨论

银屑病是一种身心免疫性疾病[14]，其病理过程有多种免疫细胞参与，在外源性因素与内源性因素的作用下，免疫细胞被激活，释放多种炎性细胞因子，导致皮损局部产生炎症反应，并刺激角质形成细胞异常增殖分化[15]。精神压力属于银屑病发病的外源性因素之一，焦虑抑郁等消极情绪既是银屑病发病的起因，也是使症状加重的不利因素；这些消极情绪的发生会使机体神经元过度分泌神经递质，导致神经递质调控的免疫细胞过度活化产生细胞因子，加重皮损炎症反应，使疾病迁延不愈或恶化[16]。Ward等[17]发现，在切除KC-Tie2转基因银屑病小鼠神经后，银屑病小鼠局部免疫细胞数量减少、表皮厚度降低、皮肤炎症减轻；注射SP激活剂，银屑病皮损和炎症反应加重；注射SP拮抗剂，皮损和炎症反应都得到改善，由此可见，干预神经递质SP可作为治疗银屑病的靶点之一。

本研究采用咪喹莫特涂抹小鼠背部皮肤造模，随着造模时间推移，模型组小鼠背部皮肤干燥，出现白色鳞屑、红斑和浸润等症状，并随时间推移不断加重；HE染色发现其皮损表皮厚度显著增加，并存在大量角化不全和角化过度；免疫组化实验中PCNA是显示角质形成细胞增殖状态的标志物，CD3可显示皮损T淋巴细胞炎症浸润程度，模型组小鼠皮损角质形成细胞异常增殖，真皮存在T淋巴细胞炎症浸润，符合临床银屑病患者的皮损表现和病理。

使用绿原酸干预咪喹莫特诱导的银屑病样模型小鼠，结果发现绿原酸可缓解银屑病样小鼠鳞屑、红斑和浸润情况，减少角化不全和过度角化，降低表皮厚度，缓解表皮层角质形成细胞过度增殖及皮损局部炎症反应。为了进一步探究其作用靶点，我们观察绿原酸对银屑病样模型小鼠焦虑行为学及神经递质的影响。

绿原酸对银屑病样模型小鼠焦虑行为学的影响：旷场实验和高架十字迷宫实验是评价小鼠焦虑状态的经典行为学实验[18,19]，我们在旷场实验中观察到空白对照组小鼠进入中央区路程、中央区时间、中央区频率均显著高于模型组，而高架十字迷宫实验结果显示，空白对照组OT%较模型组有一定升高趋势，而OE%趋势不明显，我们猜测可能与样本量大小有关，以上结果提示咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠可能存在焦虑症状，与刘正荣[7]的研究结果一致。与模型组相比，绿原酸可提高小鼠中央区路程、中央区时间、中央区频率、OE%和OT%，在一定程度上可以改善小鼠的焦虑程度。

绿原酸对银屑病样模型小鼠神经递质SP/NK1R的影响。临床中银屑病患者伴随焦虑症和抑郁症共病的发生率较高，这些患者皮损中SP的表达显著高于对照组[2,20]，NK1R是SP结合免疫细胞并产生信号传递作用的关键受体，连接神经免疫调节的关键靶点[21]，SP及其受体NK1R在焦虑抑郁疾病中起重要的调节作用[22]，并且共同参与银屑病神经免疫炎症的病理过程[23]。本研究发现，模型组小鼠皮损组织中NK1R与SP蛋白的表达量均高于空白对照组，而绿原酸治疗组小鼠皮损组织NK1R与SP蛋白的表达较模型组明显减少。推测绿原酸可能通过降低SP及其受体NK1R的表达，缓解小鼠焦虑程度。神经免疫调节介导银屑病的始终[24,25]，进一步对焦虑相关神经递质表达量与小鼠皮损组织炎症程度进行相关性分析，发现NK1R、SP的相对蛋白表达量与CD3阳性T淋巴细胞数量呈正相关，即焦虑相关神经递质表达量越高，银屑病样小鼠焦虑程度增加，局部皮损组织炎症反应越严重。综上提示绿原酸可能通过降低皮损组织中NK1R与SP的表达，缓解小鼠焦虑程度，降低炎症反应，从而改善小鼠银屑病样皮损。