宋艳玲 麦华德 林芸芸 陈明慧 王雅纯 顾申红

(海南医学院第一附属医院老年病科，海口 570000)

心肌缺血再灌注损伤是麻醉手术治疗过程中常见的一种病理变化，如体外循环下的心脏手术，心肌梗死患者进行的溶栓治疗等，都是引起心肌缺血再灌注损伤的重要原因[1]。缺血期引起的心肌超微结构、能量代谢、氧化应激、心肌损伤及线粒体凋亡等一系列损伤性变化，严重的会因心律失常而导致猝死[2，3]。山莨菪碱(Anisodamine,Anis)是一种源于茄科植物唐古特山莨菪根的生物碱，这种生物碱在缺血再灌注损伤中具有心肌保护功能，能够减少心肌梗死面积，改善微循环、防止再灌注心律失常及无复流现象的发生[4,5]。有研究表明，Anis通过降低氧化应激反应，抑制炎症介质，缓解心肌缺血再灌注损伤[6]，但具体机制尚不明确。本文旨在研究Anis对心肌缺血再灌注大鼠氧化应激、心肌损伤及线粒体凋亡通路的影响，以期了解Anis对心肌缺血再灌注损伤保护的作用机理，从而为心肌缺血提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 SPF级SD大鼠45只，体重200～300 g；购自广东医学院实验动物中心，粤监证字 2004A029号，大鼠分9个笼子饲养，每个笼子5只。所有大鼠均饲养在本院动物学部屏障环境独立通气笼，温度20～25℃，相对湿度40%～60%，该实验经过动物伦理委员会批准同意。

1.1.1药物与试剂 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)试剂盒均购自上海恒远生物科技有限公司；肌红蛋白(Myohemoglobin,Mb)试剂盒、肌酸激酶同工酶(Creatine kinase MB,CK-MB)试剂盒购自上海基免实业有限公司；IL-6免疫组化试剂盒购自美国贝克曼库尔特有限公司；诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)试剂盒购自安徽大千生物；Caspase-3抗体购自武汉华联科有限公司；苏木素、伊红购自武汉博士得生物有限公司；Bak、Bcl2、Apaf1抗体购自南京建成生物工程研究所；中性福尔马林、酒精、二甲苯购自天津科密欧有限公司。

1.1.2仪器 BS-124s型电子天平购自北京赛多斯仪器系统有限公司；TDL-5 型台式离心机购自上海安亭科学仪器厂；光学显微镜购自东莞市同创仪器有限公司；切片机购自德国Leica公司；低温离心机购自湖南恒诺离心机有限公司；DW-T6彩色多普勒超声仪购自江苏大为医疗有限公司；蛋白电泳及转膜仪购自美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统购于以色列DNR公司。

1.2方法

1.2.1分组及建立模型 将45只大鼠适应性喂养 1 周，随机选9只为健康组(Control)，其余36只大鼠分别分为：模型组(I/R)、低剂量山莨菪碱组(Anis 1 mg/kg)、中剂量山莨菪碱组(Anis 2 mg/kg)和高剂量山莨菪碱组(Anis 4 mg/kg)，采用冠状动脉结扎术建立缺血再灌注模型，制作方法及判断模型是否成功参考李言明等[7]研究。具体操作如下：腹腔注射戊巴比妥钠溶液 50 mg/kg麻醉，切开左胸第2～5肋之间的皮肤，分离皮下组织及前锯肌和胸大肌后切开第2～3肋间肌暴露心脏，结扎使得心肌细胞缺血，缺血时间为15 min后灌注10 min，1 h后再次缺血15 min后灌注10 min，消毒，缝合。

1.2.2药物干预 低剂量山莨菪碱组大鼠于缺血再灌注术前静脉注射Anis 1 mg/kg，第一次缺血再灌注后再次静脉注射Anis 1 mg/kg；中剂量山莨菪碱组大鼠于缺血再灌注术前静脉注射Anis 2 mg/kg，再灌注后静脉注射Anis 2 mg/kg；高剂量山莨菪碱组大鼠于缺血再灌注术前静脉注射Anis 4 mg/kg，再灌注后静脉注射Anis 4 mg/kg；模型组和健康组大鼠静脉注射等剂量的0.9%氯化钠溶液。

1.2.3检测项目

1.2.3.1HE染色观察 使用HE染色，具体步骤为：将大鼠处死后取大鼠心肌组织，使用二甲苯浸泡后使用酒精梯度脱水，再用苏木精浸泡，盐酸酒精分化，最后使用氨水冲洗一次，再次重复酒精冲洗过程，完成后使用伊红染色30 s后使用95%酒精浸泡1～2 min后再次使用100%酒精10～15 min，分别使用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ浸泡10～15 min最后中性树胶封片即可。使用10×40倍镜观察大鼠心肌细胞状态。

1.2.3.2心脏功能的检测 采用DW-T6彩色多普勒超声仪检测各组大鼠平均动脉压(Mean artery pressure，MAP)、左室收缩压水平(Left ventricular systolic pressure，LVSP)。

1.2.3.3氧化应激物质及心肌损伤标志水平检测 从颈总动脉插管接取1 ml 大鼠血液，严格按照MDA、SOD、CK-MB、Mb试剂盒子上的操作方法，检测其含量水平。

1.2.3.4炎症因子水平检测 从颈总动脉插管接取1 ml 大鼠血液，严格按照IL-6、iNOS ELISA试剂盒上的操作方法，使用酶联免疫吸附试验检测大鼠血清中的各成分含量水平。

1.2.3.5Western blot 检测蛋白表达水平 用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳提取总蛋白，半干法将蛋白转移到PVDF膜，置于5%脱脂奶粉室温封闭2 h后加入各需要检测蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，TBS洗净，以β-actin为内参蛋白，采用显色液显色后行吸光度分析，计算各蛋白相对表达量。

1.2.3.6免疫组化检测 本实验中免疫组化采用PV 法染色，将石蜡切片 5 μm，常规脱蜡后使用3%过氧化氢甲醇液室温浸泡 15 min并使用 4%胃蛋白酶消化15 min，滴加一抗 Caspase-3(效价1∶50)，置于湿盒中恒温冰箱保存12 h，使用0.01 mol/L PBS清洗后滴加二抗葡聚糖-酶复合物，37℃孵育60 min，再次使用0.01 mol/L PBS清洗，显色后使用苏木素复染1 min 脱水并封片，使用10×40的倍镜观察。

1.3统计学分析 本研究数据分析采用统计学软件SPSS22.0，作图软件采用GraphPad Prism5，方差分析使用单因素方差分析，当组间差异存在统计学意义时，采用SNK方法进行进一步的比较；使用单因素方差分析时，若P<0.05则表明数据差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠心肌细胞HE染色观察及心脏功能检测结果 由图1A可以看出，健康组大鼠心肌组织正常，肌外膜完整，心肌纤维完整，肌纤维纵切面可见周期性横纹(明暗相间带)，肌红蛋白溶解，肌细胞核固缩、溶解，肌束膜破裂；低剂量山莨菪碱组心肌组织少量肌纤维断裂溶解弯曲；中剂量山莨菪碱组大鼠心肌组织少量正常肌肉组织，肌外膜完整，可见血管及神经，肌束膜包裹肌纤维，肌纤维完整，肌细胞核大小形态未见异常，肌纤维纵切面可见周期性横纹(明暗相间带)；高剂量山莨菪碱组心肌组织少量肌纤维断裂溶解弯曲。由图1B可以看出，相比健康组，模型组大鼠LVSP、MAP水平显著降低(P<0.05)，相比模型组，山莨菪碱处理各组LVSP、MAP水平显著升高(P<0.05)，且随着使用山莨菪碱处理剂量增加呈剂量依赖性。

2.2大鼠氧化应激反应及心损标记物检测结果 由图2可以看出，相比健康组，模型组大鼠MDA、CK-MB、Mb水平显著升高，SOD水平显著降低(P<0.05)；相比模型组山莨菪碱处理各组MDA、CK-MB、Mb水平显著降低，SOD水平显著升高(P<0.05)且随着使用山莨菪碱处理剂量增加呈剂量依赖性。

2.3大鼠炎症因子检测结果 由图3可以看出，相比健康组，模型组大鼠IL-6、iNOS水平显著升高(P<0.05)；相比模型组山莨菪碱处理各组大鼠IL-6、iNOS水平显著降低(P<0.05)，且随着使用山莨菪碱处理剂量增加呈剂量依赖性。

2.4凋亡相关蛋白免疫组化观察及水平检测结果

图1 大鼠心肌细胞HE染色观察及心脏功能检测结果Fig.1 Rat myocardial cells observed by HE staining and test results of cardiac functionNote:A.HE staining of rat cardiomyocytes(×400);B.The result of cardiac function test in rats;compared with healthy group，*.P<0.05;compared with model group，#.P<0.05.

图2 大鼠氧化应激反应及心损标记物检测结果Fig.2 Results of oxidative stress response and heart damage markers in ratsNote:A，B.The markers of oxidative stress in rats;C，D.The results of rat heart loss markers;compared with healthy group，*.P<0.05;compared with model group，#.P<0.05.

图3 大鼠炎症因子检测结果Fig.3 Test results of inflammatory factors in ratsNote:A.The result of IL-6 test;B.The result of iNOS test;compared with healthy group，*.P<0.05;compared with model group，#.P<0.05.

图4 凋亡相关蛋白表达检测结果Fig.4 Expression of apoptosis-related proteins was detectedNote:A.The immunohistochemical observation of Caspase-3(×400);B.The relative level of Caspase-3 protein imprinting;compared with healthy group，*.P<0.05;compared with model group，#.P<0.05.

由图4A可以看出，相比健康组，模型组大鼠Caspase-3阳性细胞百分比显著升高(P<0.05)；相比模型组大鼠，山莨菪碱处理各组大鼠Caspase-3阳性细胞百分比显著降低(P<0.05)，且随着使用山莨菪碱处理剂量增加呈剂量依赖性。由图4B可以看出，相比健康组，模型组大鼠Caspase-3水平显著升高(P<0.05)；相比模型组山莨菪碱处理各组大鼠Caspase-3水平显著降低(P<0.05)，且随着使用山莨菪碱处理剂量增加呈剂量依赖性。

2.5线粒体凋亡通路相关蛋白检测结果 由图5可以看出，相比健康组，模型组大鼠Bak、Bcl2、Apaf1水平显著升高(P<0.05)；相比模型组大鼠，山莨菪碱处理各组大鼠Bak、Bcl2、Apaf1水平显著降低(P<0.05)，且随着使用山莨菪碱处理剂量增加呈剂量依赖性。

图5 线粒体凋亡通路相关蛋白检测结果Fig.5 Test results of mitochondrial apoptosis pathway-related proteinsNote:A.The Bak protein level test result;B.The Bcl2 protein level test result;C.The Apaf1 protein level test result;compared with the healthy group，*.P<0.05;compared with the model group #.P<0.05.

3 讨论

LVSP是心脏向动脉射血的主要动力，在心脏舒张时内压降低，腔静脉血压回流入心脏，心脏每收缩和舒张一次构成一个心动周期[8]。MAP为一个心动周期中动脉血压的平均值称为平均动脉压[9]。本研究发现，使用山莨菪碱处理各组大鼠，心肌细胞肌纤维断裂溶解弯曲和凋亡细胞显著减少，且LVSP、MAP水平显著升高，说明山莨菪碱可以有效保护大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤同时有效改善心脏功能。邢坤[10]研究表明：山莨菪碱可以缓解缺血再灌注损伤，与本研究得出的结论相一致。

随着生活和医疗的需要活性氧族的研究越来越成熟，在健康的细胞内氧自由基的产生和清除是平衡的，但是在氧化应激情况下，会产生大量的ROS，对细胞膜造成损伤，同时还会导致上皮细胞膜通透性增加，使得细胞内的SOD、GPX等酶释放至细胞外[11]。MAD的含量可以反映机体内发生脂质过氧化的程度，使自由基与生物膜中的多不饱和脂肪酸发生反应并使得氧化产物分解，由此可以得知MAD的含量可间接反映出细胞损伤的程度[12]。血清中IL-6、iNOS的水平与心肌炎症呈正相关，心肌细胞炎症越严重IL-6、iNOS水平越高，同时心肌细胞损伤的程度越高[13]。从本实验中可以看出，使用山莨菪碱处理的各组MDA水平降低、SOD水平升高，说明大鼠体内氧化应激被抑制。IL-6、iNOS水平显著降低，说明山莨菪碱可以缓解心肌细胞炎症反应，降低缺血再灌注后的损伤。张杰等[14]研究表明：山莨菪碱可以通过抑制氧化应激保护缺血再灌注损伤，与本研究得出的结论相一致。

细胞凋亡是受基因调控的一种程序性死亡，其中Caspase是细胞凋亡的核心。Caspase-3、Caspase-9是Caspase家族的凋亡因子[15]，在Caspase家族中主要执行凋亡的基因为Caspase-3[16]。研究表明：在线粒体中存在Cyt-c蛋白，在细胞凋亡时线粒体会促进这种蛋白的释放，Cyt-c蛋白进入细胞质中会与细胞质Apaf1相互作用，导致Caspase-9活化，有活性的 Caspase-9裂解使得 proCaspase-3 产生有活性的 Caspase-3，并通过剪切另外的 Caspase 底物引起级联反应，实现控制肿瘤细胞的凋亡[17]。本研究发现使用山莨菪碱处理各组Apaf1蛋白水平显著降低，说明山莨菪碱抑制了线粒体释放Cyt-c和Apaf1进入细胞浆，有效抑制了由线粒体介导的信号途径启动的细胞凋亡，同时心肌细胞内Caspase-3阳性率及蛋白表达水平显著降低，说明山莨菪碱可以通过抑制Caspase-3的表达，阻止心肌细胞缺血后的程序性死亡，实现保护心肌细胞的作用。孟晓燕[18]研究表明：山莨菪碱可以抑制Caspase-3的表达活化，与本研究得出的结论相一致。

细胞凋亡的调控因子较多，不仅有 Caspase 家族，Bcl2家族也是一种常见的凋亡控制基因[19]。Bcl2家族中主要包括：Bcl2、Bax和Bak。Bax和Bcl2表达呈相反趋势，当Bcl2表达下降时 Bax和Bak表达上升，此时会促进细胞的凋亡；当Bcl2表达升高，而 Bax和Bak表达降低时，则会抑制细胞的凋亡[20]。其中Bak可以诱导线粒体碎裂和细胞色素C释放，并刺激Bax的表达，两者协同细胞的凋亡[21]。本实验中发现使用山莨菪碱处理后Bak水平显著降低，说明山莨菪碱可以通过降低Bcl2家族的细胞凋亡因子实现缓解大鼠心肌细胞缺血再灌注后的损伤。容俊芳等[22]研究表明：山莨菪碱可以下调Bax，上调抗凋亡蛋白Bcl2，从而抑制心肌细胞凋亡，与本研究得出的结论相一致。

综上所述，山莨菪碱可以通过降低氧化应激、抑制凋亡相关蛋白表达及线粒体凋亡通路实现缓解心肌缺血再灌注损伤，其作用机制可能与抑制体内氧化应激反应阻止体内过氧化损伤，其作用机制可能与抑制体内氧化应激反应阻止体内过氧化损伤相关。但本研究涉及到的Anis剂量较少，在后续的实验中将使用更多浓度梯度的Anis作用于心肌细胞缺血再灌注损伤的大鼠，探讨不同Anis浓度对心肌细胞缺血再灌注损伤的作用效果。