余柯达 陈 晓 杨丽华 毛佳婷 邹立波 师 帅 刘 鸿

金华市人民医院生殖医学中心（浙江金华 321000）

自从Palermo等[1]首次通过卵胞浆内单精子注射（ICSI）获得妊娠后，男性不育症患者可通过ICSI得到有效的治疗。对于男性不育症中的无精子症，在确诊梗阻性无精子症还是非梗阻性无精子症时需要通过经皮附睾精子抽吸术（PESA）和睾丸精子抽吸术（TESA）进行检查，为避免反复穿刺给患者带来损伤，很多生殖医学中心会将检查后确认有精子的PESA和TESA标本进行冷冻保存，用于后续的ICSI周期。

不同来源 （PESA/TESA）的精子是否会影响ICSI助孕的结局，目前国内外研究无统一结论[2-6]。PESA和TESA精子经过冻融后会受到一定的损伤，其是否会影响ICSI助孕的结局目前还存在争议。有研究结果表明冻融的PESA和TESA精子对ICSI的受精率、早期胚胎质量和临床妊娠率等无影响[2,7-10]，但也有些学者认为冻融的精子会对ICSI助孕结局造成影响[11,12]。本研究对在本院生殖中心接受ICSI治疗的312个周期进行回顾性分析，旨在探讨不同来源精子（PESA/TESA）和冻融TESA/PESA精子对ICSI助孕结局的影响。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2014年1月至2017年2月在金华市人民医院生殖医学中心因男方无精子症接受采用PESA或TESA精子行ICSI治疗的312个周期。根据ICSI的精子来源不同，分为新鲜PESA精子组（P组）117周期，新鲜TESA精子组（T组）66周期，冻融PESA精子组（FP组）85周期，冻融TESA精子组（FT组）44周期。

纳入标准：（1）男方至少3次精液分析，经离心沉淀后镜检未见精子，PESA或TESA可见成熟精子；（2）第1 周期行 ICSI助孕治疗；（3）女方年龄＜35 岁；（4）夫妇双方染色体均正常；（4）女方无子宫畸形、子宫内膜异位症和卵巢功能衰竭等。所有患者均签署知情同意书。

二、方法

（一）超排方案

女方超排卵均采用GnRH-a长方案，注射促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a，达菲林，法国益普生生物制药公司）进行降调，达到降调标准后，开始注射重组人促卵泡激素（rFSH，果纳芬，瑞士雪兰诺公司）或人绝经期促性腺激素（hMG，珠海丽珠公司）促排卵，并根据卵泡发育、子宫内膜及血清雌二醇（E2）、促黄体生成素（LH）的值调整剂量，当至少3个卵泡≥18 mm时停用促排药，注射人绒毛膜促性腺激素（hCG，艾泽，瑞士雪兰诺公司）6000 U，36 h后取卵。

（二）PESA和TESA精子获取、冷冻和复苏

1.PESA：患者取仰卧位，常规消毒铺巾，进行局部麻醉。经皮穿刺附睾头部，抽取附睾液，并在倒置显微镜下寻找活动精子。若附睾液中无活动精子，甚至无精子，则行对侧附睾穿刺。若两侧附睾均无精子，则行TESA。

2.TESA：消毒麻醉同PESA，经皮穿刺睾丸，抽吸出睾丸组织液和少量生精小管，将生精小管撕碎后，在倒置显微镜下检查有无精子。若无精子，则穿刺对侧睾丸。

精子冷冻和复苏参照精子冷冻液（vitrolife）的使用说明书的操作步骤进行。

（三）受精、卵裂、胚胎质量观察及妊娠结局随访

取卵当天行常规ICSI，受精16～18 h后观察受精情况，其中2 PN为正常受精，再观察第2天和第3天胚胎卵裂情况，第3天早期胚胎的卵裂球≥6，细胞大小均匀或基本均匀，碎片≤20%为优质胚胎，选择正常受精卵卵裂而来的优质胚胎或有效胚胎进行移植。胚胎移植30 d后B超检查宫腔，内见孕囊确诊为临床妊娠。对妊娠夫妇每3个月进行一次随访并作记录。

三、统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差表示，采用t检验。计数资料比较采用卡方检验，当病例数≥40且理论频数≥5时，采用普通卡方检验；当病例数≥40，但1≤理论频数＜5时，采用校正的卡方检验；当病例数＜40或理论频数＜1时，采用Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、冻存附睾、睾丸精子的复苏情况和患者基础临床资料比较

85个周期冻存附睾精子和44个周期冻存睾丸精子进行复苏后，每个周期均能找到足够数量的活动精子进行ICSI，附睾、睾丸精子的冻融复苏成功率均为100%。患者基础临床资料方面，4组之间的女方年龄、男方年龄和不孕年限均无统计学差异（P＞0.05，表 1）。

二、受精情况与胚胎质量

由表1可知，P组的受精率为78.12%，而T组仅为71.04%，具有极显著统计学差异（P＜0.01）。精子经过冷冻复苏后，FP组的受精率仍高达 77.65%，FT组为69.57%，FP组与P组、FT组与T组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；且FP组的受精率显著高于FT组，差异具统计学意义（P＜0.01）。P组、T组、FP组和FT组的卵裂率分别为97.45%、97.93%、96.86%和98.18%，精子不同来源的P组与T组、FP组与FT组之间差异均无统计学意义（P＞0.05）；且经过冷冻复苏后的FP组、FT组的卵裂率也与采用新鲜精子的P组、T组无统计学差异（P＞0.05）。有效胚胎率和优质胚胎率也与卵裂率情况一致。总之，除不同来源的精子之间受精率有显著差异性（P＜0.01）之外，不同来源的精子，无论是新鲜的还是冻融的精子，其卵裂率、有效胚胎率和优质胚胎率均无统计学差异（P＞0.05）。

三、临床妊娠情况比较

胚胎移植后，P组、T组、FP组和FT组的胚胎种植率分别为31.19%、30.36%、31.25%和33.33%，精子不同来源的P组与T组、FP组与FT组之间差异均无统计学意义（P＞0.05），且经过冷冻复苏后的FP组、FT组的胚胎种植率也与采用新鲜精子的P组、T组差异无统计学意义（P＞0.05）。临床妊娠率、早期流产率、多胎妊娠率和异位妊娠率也与胚胎种植率一致。不同来源的精子，无论是新鲜还是冻融的精子其胚胎种植率、临床妊娠率、早期流产率、多胎妊娠率和异位妊娠均无统计学差异（P＞0.05，表 2）。

表1 4组基本情况和胚胎发育情况比较

表2 4组临床妊娠情况比较

讨 论

一个成熟的精子必须具备一些生理生化指标才能使它获得受精能力，然而显微操作辅助的受精实验表明大多数的高度特化精子在成熟过程中逐渐获得的功能只需要将精子的细胞核注射到卵子就能代替那些功能，从而激活卵子[1]。因此ICSI技术成为了男性不育症患者，特别是无精子症患者的有效治疗方式，梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症患者通过PESA或TESA获得附睾或睾丸精子行ICSI治疗。不同来源的精子对ICSI治疗中的胚胎发育和临床结局的影响，目前国内外的研究均无统一结论。

王俊霞等[3]报道PESA/TESA不同来源的精子对受精率、卵裂率、临床妊娠率等均无显著差异，但PESA的流产率显著低于TESA。冼志勇等[13]也认为PESA和TESA之间的临床妊娠率无显著性差异。而有些研究结果表明附睾来源的精子受精率显著高于TESA，且流产率差异无显著性[4,5]。Dozortsev等[6]的研究结果则认为不同精子来源中的PESA的受精率虽然显著高于TESA，但临床妊娠率显著低于TESA，流产率则高于TESA。而董瑞娜等[2]认为不仅PESA的受精率、卵裂率显著高于TESA，而且胚胎种植率、临床妊娠率也显著高于TESA。本研究结果表明，新鲜PESA精子组（P组）的受精率为78.12%，而新鲜TESA精子组（T组）仅为71.04%，具有极显著统计学差异（P＜0.01），而卵裂率、有效胚胎率、优质胚胎率、胚胎种植率、临床妊娠率、早期流产率、多胎妊娠率和异位妊娠率两组间差异无统计学意义（P＞0.05），冻融后的FP组和FT组之间也具有上述同样的结果，这与林小民[4]和谢多等[5]的研究结果一致。在睾丸中精子具备完整的父源遗传物质，已完成减数分裂，在循附睾头体尾运动和在附睾储存的过程中，精子的形态和生理生化功能进一步发生改变，最终获得运动能力、精卵识别能力和受精能力，因此睾丸中的精子对卵子的激活能力比附睾中的低，所以导致TESA精子的受精率显著低于PESA精子。

冻融TESA和PESA精子对ICSI助孕结局的影响目前国内外尚无统一的结论。Romero等[11]认为冻融睾丸精子的受精率高于新鲜睾丸精子，对卵裂率和胚胎质量无影响。而Verheyen等[12]则认为冻融睾丸精子对受精率无影响，但严重降低了卵裂率。然而国内外多数研究结果表明[2,7-10]，冻融TESA和PESA与新鲜TESA和PESA之间的受精率、卵裂率、优质胚胎率、多胎率、流产率和异位妊娠率等均无统计学差异。本研究结果也表明冻融TESA和PESA精子对ICSI结局中的受精率、卵裂率、有效胚胎率、优质胚胎率、胚胎种植率、临床妊娠率、早期流产率、多胎妊娠率和异位妊娠率无影响。究其原因可能是在精子冷冻和复苏的过程中虽然会对精子产生损伤，但也起到了筛选的作用，只有代谢旺盛、活力好的精子才能存活下来。

受目前试管婴儿成功率的限制，无精子症患者可能会进行多次附睾或睾丸穿刺，还要面临取不到精子的可能，重复的睾丸手术取精会导致患者睾丸的损伤和大量的睾丸组织丢失，并引起睾丸组织纤维化、睾丸萎缩等并发症[10]。因此本文建议将检查到具有精子的附睾和睾丸活检的样品或ICSI治疗周期剩余的PESA和TESA精子进行冷冻保存，可用于接下来的ICSI周期，避免患者多次附睾或睾丸穿刺取精带来的损伤。