李明如，聂振凯，林贵湖，张凯华

中国航天科工集团七三一医院胸外科，北京100074

肺腺癌是最常见的肺癌类型，也是最致命和最常见的癌症之一[1]。肺腺癌患者的5 年总生存率仅为11%，严重威胁着人类健康[2]。因此，阐明肺腺癌发生的分子机制，寻找新的预后标志物和分子治疗靶点，提高对人肺腺癌的诊断、预防和治疗水平，已成为当务之急。ERBB4 是表皮生长因子受体家族成员，在生理和病理过程中起重要作用。但ERBB4 在癌症中的作用仍存在争议。长期以来，ERBB4 一直被认为是一种致癌基因，如是黑色素瘤的潜在治疗靶点[3]，促进尤文氏肉瘤的转移[4]和人乳腺癌细胞的增长[5-6]，甚至可以提高肺癌细胞的增殖潜能[7]。然而，一些研究结果却表明ERBB4 在肿瘤中发挥着抑癌的作用，如促进乳腺癌细胞周期阻滞和凋亡[8-9]，ERBB4 缺失会促进肝细胞肿瘤的发生[10]。最近有研究发现ERBB4 的缺失通过抑制肿瘤抑制因子TP53 诱导核蛋白 1（TP53- inducible nucleoprotein 1，TP53INP1）的表达来抑制p53 基因的表达，从而促进了肝癌的发生发展[10]。本研究旨在探究ERBB4与TP53INP1 在肺腺癌中的表达作用关系，并揭示ERBB4 的表达对肺腺癌预后的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

20 例肿瘤组织样本来自在中国航天科工集团七三一医院治疗的肺腺癌患者；肺腺癌细胞系SPC-A-1、H1299 和人正常肺上皮细胞BEAS-2B购自中国科学院细胞库，均采用RPMI-1640 培养基（添加10%胎牛血清），于37℃、含5% CO2湿化气氛的培养箱中生长；pGL3 载体购自上海康朗生物科技有限公司；RPMI-1640 培养基、胎牛血清购自Gibco 公司；LipofectAMINE 3000 试剂盒、TRIzol试剂购自Invitrogen 公司；逆转录试剂盒购自大连TaKaRa 公司；双萤光素酶报告基因检测试剂购自Promega 公司；TP53INP1、ERBB4、β-actin 及含辣根过氧化物酶的二抗购自Abcam 公司；化学发光成像系统购自BioRad 公司。

1.2 细胞转染及过表达载体构建

用LipofectAMINE 3000 试剂盒对H1299 细胞中的ERBB4 转染siRNAs，分为si-ERBB4 组和si-NC 组。将PCR 扩增得到的ERBB4 基因克隆到慢病毒载体中，滴度检测后，将成功包装的过表达载体和阴性对照载体转染肺腺癌细胞H1299，分为oe-ERBB4 组和oe-NC 组。

1.3 数据生物信息学分析

通过Kaplan-Meier plotter 分析平台（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service），在线分析来自TCGA 数据库的TP53INP1 和ERBB4 基因表达数据与肺腺癌生存预后的关系。

1.4 RNA 提取和qRT-PCR

用TRIzol 试剂提取总RNA，用逆转录试剂盒反转cDNA，采用SYBR 荧光染料进行qRT-PCR。标准化为β-actin mRNA 的表达。TP53INP1 正义引物为5′-GCCTAAAGGCTACGGACTATTGC-3′，反义引物为5′-GGACCTAATCGAATGCTATTCAGA-3′；ERBB4 正义引物为5′-GTTGGCAGTCCAGCTA TGCAATAC-3′，反义引物为5′-CTATACGATACCTCCAACTAGGA-3′。实时定量PCR 反应一式3份。基因表达的相对水平采用2-ΔΔCt法计算。

1.5 Western 印迹分析

将热变性的蛋白样品点至SDS-PAGE 胶中，电泳结束后湿转到PVDF 膜，用5%脱脂牛奶封闭，加入一抗，4℃孵育过夜，TBST 洗涤后，与标记有辣根过氧化物酶的二抗孵育1 h，TBST 洗涤后向膜中加入化学显色剂，反应5 min，用化学发光成像系统成像检测。

1.6 萤光素酶报告基因检测实验

将含有miR-193a-3p 结合位点或突变位点的TP53INP1 或ERBB4 的3′UTR 全长序列克隆到pGL3 载体，然后用100 nmol/L 的miR-4461 模拟物或NC 模拟物转染肺腺癌细胞24 h（NC 模拟物正义引物为5′-CGACUGGUACCAAUGAAC-3′，miR-193a-3p 模拟物正义引物为5′-GCAAUGAC AAGCUUACGAAGG-3′。萤光素酶相对活性统一化为海肾萤光素酶活性，用双萤光素酶报告基因检测试剂测定。

1.7 CCK-8 法检测细胞增殖

实验分为si-NC 组、si-ERBB4 组、si-ERBB4+miR-193a-3p 抑制剂组及si-ERBB4+oe-TP53INP1组，各组细胞以2×104/孔接种于96 孔板，每组3 个重复，在37℃恒温培养箱中培养，分别于24、48、72 和96 h 后加入10 μL CCK-8，1 h 后在酶标仪上测定各孔的D450nm值，以时间为横坐标、D450nm值为纵坐标细胞制增殖曲线。

1.8 统计分析

用GraphPad Prism 7 进行统计学分析。计量数据以x±s表示，2 个独立组均值间差异采用t检验，3 组以上的组间比较采用方差分析法（One-Way ANOVA），组内两两多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌组织和细胞中的表达

为了探究ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌中的表达，我们检测了20 对肺腺癌组织和癌旁组织中ERBB4 和TP53INP1 的表达，还检测了在肺腺癌细胞系SPC-A-1、H1299 和人类肺上皮细胞BEAS-2B 中ERBB4 和TP53INP1 的表达。如图1A、B 所示，肿瘤组织中ERBB4、TP53INP1 的表达均比在癌旁组织中低（均为P＜0.0001)，差异具有统计学意义。如图1C 所示，与人肺上皮细胞BEAS-2B相比，SPC-A-1、H1299 细胞系ERBB4 和TP53INP1表达均显著降低（均为P＜0.05），差异具有统计学意义。该结果提示，ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌中表达均较低，且组织和细胞系具有一致性。

2.2 ERBB4/TP53INP1 的表达与肺腺癌预后相关

为了探究ERBB4/TP53INP1 表达与肺腺癌预后的关系，我们应用Kaplan-Meier Plotter 分析了ERBB4/TP53INP1 表达与肺腺癌预后的相关性。如图2 所示，肺腺癌组织中ERBB4/TP53INP1 高表达与整体生存期（overall survival，OS）良好显著相关，ERBB4/TP53INP1 表达越高，肺腺癌的预后效果就越好，ERBB4 或TP53INP1 表达均可以作为肺腺癌患者整体生存率的独立预后指标。同时这些结果也表明，ERBB4 和TP53INP1 可能在人类肺腺癌的发生发展过程中发挥关键作用。

2.3 ERBB4 与TP53INP1 的表达相关性分析

从上述肺腺癌组织和细胞中的ERBB4 和TP53INP1 表达结果，推测两者在肺腺癌中的表达可能具有一定的相关性。为此我们做了进一步检测，结果表明ERBB4 和TP53INP1 的mRNA 表达呈正相关（R2=0.7488，P＜0.0001）（图3）。

图1 ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌组织和细胞中的表达水平

图2 ERBB4/TP53INP1 的表达与肺腺癌预后相关

2.4 ERBB4 沉默/过表达对TP53INP1 蛋白表达的影响

ERBB4 与TP53INP1 的mRNA 表达呈正相关，那么ERBB4 蛋白表达的增减是否影响TP53INP1的蛋白表达量呢？通过Western 印迹检测ERBB4沉默/过表达对TP53INP1 蛋白表达的影响，结果如图4，si-ERBB4 沉默表达，TP53INP1 的蛋白表达也明显降低，而ERBB4 过表达时，TP53INP1 的蛋白表达量也明显增加。该结果表明ERBB4 沉默或过表达也会影响TP53INP1 蛋白的表达。

2.5 ERBB4 通过靶向miR-193a-3p 调控TP53INP1的表达

图3 ERBB4 与TP53INP1 的表达相关性分析

图4 Western 印迹检测ERBB4 沉默/过表达对TP53INP1 蛋白表达的影响

无论mRNA 还是蛋白表达，ERBB4 和TP53INP1 都呈现密切的相关性。为了探究其中的联系，我们通过starBase 靶向预测了ERBB4 和TP53INP1 的3′UTR 均有miR-193a-3p 的结合位点，并采用肺腺癌细胞系H1299 进行萤光素酶报告基因检测，检测结果（图5）也验证了这一点。过表达miR-193a-3p 抑制了ERBB4 和TP53INP1野生型3′UTR 萤光素酶活性（均为P＜0.05），差异具有统计学意义，但是对ERBB4 和TP53INP1 的突变型3′UTR 萤光素酶活性却没有影响。该结果提示ERBB4 可能通过靶向调控miR-193a-3p 来调节TP53INP1 的表达，三者构成竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）调控网络。

2.6 ERBB4-miR-193a-3p-TP53INP1 对肺腺癌细胞增殖的影响

我们进一步探究了ERBB4、miR-193a-3p 和TP53INP1 三者之间的作用联系。如图6 所示，沉默ERBB4 后细胞增殖速率显著增加，但联合miR-193a-3p 抑制剂或过表达TP53INP1 后细胞增殖速率降低，说明miR-193a-3p 抑制剂和过表达TP53INP1 能够恢复由沉默ERBB4 造成的细胞增殖率增加，ERBB4 可通过miR-193a-3p/TP53INP1影响肺腺癌细胞增殖。

3 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，是导致癌症相关死亡的主要原因[11]；而肺腺癌是最常见的肺癌类型，占原发性肺癌的30%～35%[12]。因此，探究肺腺癌的分子发生机制，对诊断和治疗肺癌有着十分重要的意义。ERBB4 在不同人类肿瘤的生长和进展过程中发挥重要作用，但ERBB4 对肿瘤的作用还存在争议。有研究表明ERBB4 发挥促癌作用[3-7]，但也有研究表明ERBB4 在肿瘤中发挥着抑癌作用[8-10]。传统上，ERBB4 作为细胞表面受体参与信号转导，但有研究揭示了ERBB4 可以作为基因转录的辅助因子发挥作用，ERBB4 与配体结合后可分裂成多个片段并释放胞质内结构域，然后胞内结构域会移位到细胞核，作为共转录因子，导致基因表达的激活[5,13]。如ERBB4 的下调会导致TP53INP1 的转录抑制[10]。我们知道，TP53INP1 是一种关键的肿瘤抑制因子，通过增强p53 功能，可以抑制肿瘤的发生[14]。所以，本研究的目的就是探究ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌中的表达及其作用关系。

图5 萤光素酶报告基因检测ERBB4 和TP53INP1 均为miR-193a-3p 的靶基因

图6 ERBB4-miR-193a-3p-TP53INP1 轴对肺腺癌细胞增殖的影响

本研究结果显示，ERBB4 与TP53INP1 在肺腺癌组织和细胞中均明显低于正常对照，且两者的表达呈正相关的关系，ERBB4 沉默或过表达使TP53INP1 的蛋白表达也相应减少或增加。该结果预示着ERBB4 的表达与TP53INP1 的表达可能存在某种联系。随后我们通过靶基因预测软件starBase 和萤光素酶报告基因检测发现ERBB4 和TP53INP1 均是miR-193a-3p 的靶基因，均受miR-193a-3p 的调控表达。Liang 等[15]也发现ERBB4 受miR-193a-3p 靶向调控。本结果表明ERBB4 通过靶向调控miR-193a-3p 来调节TP53INP1 的表达，三者构成ceRNA 调控网络，通过细胞增殖实验发现miR-193a-3p 抑制剂和过表达TP53INP1 能够缓解由沉默ERBB4 提高的细胞增殖，ERBB4 可以通过miR-193a-3p-TP53INP1 影响肺腺癌进展。Kaplan-Meier 生存曲线结果显示肺腺癌组织中ERBB4 和TP53INP1 均高表达，与OS 良好显著相关，ERBB4/TP53INP1 表达越高，肺腺癌的预后效果就越好，ERBB4 或TP53INP1 表达均可以作为肺腺癌患者整体生存率的独立预后指标。

综上所述，ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌组织或细胞中均低表达，2 个基因的表达呈正相关，ERBB4通过靶向调控miR-193a-3p 来调节TP53INP1 的表达，且ERBB4 和TP53INP1 表达越高，肺腺癌的预后效果就越好。ERBB4 或TP53INP1 表达可以作为肺腺癌患者预后指标。