张利伟 石安辉 娄志霞 刘苓苓 孙瑞霞

(1中国科学院合肥肿瘤医院肿瘤放疗科，安徽 合肥 230031；2北京大学肿瘤医院放疗科)

肺癌是目前全世界范围内发病率和恶性程度最高的恶性肿瘤，我国约85%肺癌属于非小细胞肺癌(NSCLC)，50%～75%患者确诊时已处于中晚期，丧失了早期手术切除机会，放化疗是主要的临床治疗方案。常规分割放疗主张单次小剂量、增加放疗次数，虽然提高了放疗安全性，在放疗间歇期增加了肿瘤细胞再氧合、细胞周期再分布，也提高了下一次分割照射的敏感性〔1〕，但同时也发现更多的肿瘤细胞存活，增殖加快，导致再群体化，增加了放射抵抗性〔2〕。也有研究指出〔3〕，放疗本身作为一种应激源，对肿瘤群体起到筛选作用，使原本不耐受放疗的肿瘤细胞死亡，而放疗耐受的细胞存活下来继续增殖和转移。大分割适形放疗通过提高单次放疗剂量和缩短放疗次数，较常规放疗提高了肿瘤细胞杀伤力度，缩短了整体治疗疗程，有效控制局部病灶，抑制肿瘤细胞的存活和再增殖活性，减少了放疗抵抗，提高了患者存活率〔4〕。放疗抵抗的产生导致放疗失败，患者临床预后变差。放疗抵抗的产生是多基因、多因子和多机制共同参与的病理生理过程，与放疗方案、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信号通路活化程度、肿瘤干细胞的产生、多种微小RNA(microRNAs)的表达、肝细胞生长因子受体(HGFR)活性〔5～7〕等密切相关。本研究主要探讨大分割适形放疗在晚期NSCLC患者中的应用及放疗抵抗发生与血清miR-123和HGFR表达的关系。

1 对象与方法

1.1对象资料 回顾性总结2015年1月至2017年12月中国科学院合肥肿瘤医院及北京大学肿瘤医院确诊晚期NSCLC患者86例临床资料，纳入标准：①经影像学或CT引导肿瘤穿刺或支气管镜细胞活检病理确诊NSCLC；②TNM分期Ⅲb～Ⅳ期；③Karnofsky功能状态(KPS)评分≥75分；④接受单纯的大分割适形放疗；⑤坚持完成规定疗程，取得知情同意，临床资料完善。排除标准：①存在放疗禁忌；②应用化疗、生物治疗；③严重肝肾功能障碍。86例患者中男50例，女36例，年龄58～79〔平均(65.5±7.8)〕岁，体重指数(BMI)22.5～26.5〔平均(24.5±2.3)〕kg/m2，Ⅲb期62例，Ⅳ期24例，原发肿瘤最大直径2.5～5.6〔平均(3.9±1.1)〕cm。

1.2放疗方法 入院完善相关检查，评估疾病严重程度和放疗风险，大分割适形放疗具体方案为仰卧位，医科达公司(Electa)6D-Axesse高能直线加速器；压力传感器，定位体框架，真空负压垫体位固定，Philips Brilliance CT Big Bore完成4DCT平扫+常规增强，对治疗靶区与危及器官进行勾画，确定内大体肿瘤体积(IGTV)、内临床靶区(ICTV)、计划靶区(PTV)；95%等剂量曲线对计划靶体积环绕，设定容积调强放疗(VMAT)单弧或者双弧旋转照射。处方剂量DT：3.5～6.0 Gy/次，5次/w，总剂量48～60 Gy，共2～3 w，同时对危及器官进行限量，注意对放疗区域外的器官进行保护，放疗间隙期加强营养支持，密切监测各项生命体征和血生化，对不适反应进行对症处理。

1.3研究方法 放疗结束后1个月评估临床疗效，入组患者至少存在一个可测量体积的原发肿瘤病灶，临床疗效参照实体瘤标准〔8〕分为显效、有效、稳定和无效，其中显效为肿瘤体积较基线水平至少缩小70%，无明显并发症，至少稳定1个月不复发；有效为肿瘤体积缩小40%～69%，至少稳定1个月不复发；稳定为肿瘤体积缩小≤39%，无新发肿瘤病灶；无效为肿瘤体积较前增加，或出现新发肿瘤病灶，或出现严重放疗并发症，需要终止治疗。将显效和有效定义为放疗敏感，稳定和无效定义为放疗抵抗。采用反转录PCR(RT-PCR)检测血清miR-123水平，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清HGFR水平。采集患者清晨空腹肘静脉血10 ml，2 500 r/min离心15 min取上层血清，分装2只EP管中，-80℃保存待检，一支用于miR-123检测，一支用于HGFR检测。ELISA试剂购自美国Sigma公司，严格按照说明书步骤进行。

1.4RT-PCR主要步骤 在装有两组样品试管中加入等体积萃取试剂Trizol，根据提示一步法提取完整细胞中RNA，减少RNA变性损失；然后测定其浓度和纯度，根据反转录试剂盒提示合成cDNA；设计引物序列，miR-123：正义链5′-GGTTTCATCCAGGATCGAGCAGG-3′，反义链5′-ACAAAGATGGTCACGGTCTGCC-3′，445 bp；内参GAPDH：正义链5′-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3′，反义链：5′-GCACTGTGTTGGCGTACAGG-3′，225 bp。反应体系为cDNA 2 μl+上下引物各 3 μl+Taq 聚合酶0.5 μl，加无菌反应水至总体积为25 μl，反应条件为95℃ 5 min，(95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s)×30个循环，72℃ 10 min结束。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，数码照相行灰度值分析，结果以目标引物与内参引物的灰度比值表示。

1.5统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行t及χ2检验。

2 结 果

2.1放疗抵抗的发生 86例患者均顺利完成放疗，疗效评估中显效39例，有效21例，稳定15例，无效11例，60例表现放疗敏感，26例表现抵抗；两组临床资料差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 放疗敏感组和抵抗组临床资料比较

2.2两组血清miR-123水平的比较 敏感组放疗前和放疗后1个月血清miR-123水平明显低于抵抗组同时点(P<0.05)，敏感组放疗后明显低于放疗前(P<0.05)，但抵抗组放疗后与放疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组血清miR-123水平的比较

2.3两组血清HGFR水平比较 敏感组放疗前和放疗后1个月血清HGFR水平明显低于抵抗组同时点(P<0.05)，敏感组放疗后明显低于放疗前(P<0.05)，但抵抗组放疗后与放疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两组血清HGFR水平的比较

3 讨 论

肿瘤均会对放疗产生一定的抵抗，不同的肿瘤对不同的放疗方案产生抵抗率不同，这是目前临床研究的热点和难点〔9〕。关于放疗产生的机制学说也有多种，认为与亚致死性损伤和再修复、细胞再增殖、细胞周期再分布和再氧和、微环境改变和乏氧细胞成分等有关〔10〕。放疗在杀伤肿瘤细胞的同时，存活细胞和即将死亡细胞及周围组织间质之间存在广泛的联系，经多种细胞因子、激素和生长因子进行信号转导，进而影响肿瘤细胞基因的表达，最终产生放疗抵抗〔11〕。

本研究结果提示，晚期NSCLC患者经大分割适形放疗后产生抵抗率为30.2%。但是不同的研究对放疗抵抗的定义不同，导致不同研究结果差异较大。目前对放疗抵抗的定义也没有统一标准。本研究着眼于临床实际，采用放疗后1个月肿瘤体积的变化区分放疗效果，有一定的参考意义。本研究中放疗敏感组与抵抗组患者的性别、年龄、BMI、肿瘤分期、最大直径、病理分型和组织分化程度比较均无差异，提示患者和肿瘤的一般特征对预测放疗抵抗风险可能价值不大。进一步发现，敏感组放疗前和放疗后1个月血清miR-123和HGFR水平明显低于抵抗组，敏感组放疗后明显低于放疗前，但抵抗组放疗后与放疗前比较差异不明显，提示血清miR-123和HGFR水平上调可能预示放疗抵抗的风险增加。

miR-123是一类19～25个核苷酸组成的小单链内源性非编码RNA，主要生物学功能是与特定mRNA结合，阻断效应蛋白编码基因的表达，激活致癌通路、抑制抑癌基因活性、诱导相关肿瘤蛋白的表达来参与放疗抵抗〔12〕。体外肺癌A549细胞实验发现〔13〕，放射敏感细胞群中miR-123表达水平明显高于抵抗细胞群，考虑与miR-123增加了放疗过程中肿瘤细胞阻滞于G1期，诱导更多细胞凋亡有关。miR-123也表现抑癌效应，调节神经纤毛蛋白(NRP)-1表达活性增强NSCLC细胞的放射敏感性〔14〕。miR-123还能够抑制HGF/c-Met信号通路活性，诱导NSCLC细胞凋亡，降低放疗抵抗〔15〕。HGFR能够与HGF特异性结合，HGF/c-Met是由c-Met原癌基因编码的跨膜酪氨酸激酶受体，是肿瘤细胞增殖、侵袭及转移过程中重要的信号通路〔16〕。约40%以上NSCLC组织中c-Met呈阳性表达，c-Met阳性往往预示NSCLC患者临床预后较差〔17〕。HGFR表达上调提示HGF/c-Met信号通路活性增强，对放疗抵抗风险增加，内在机制与放疗诱导肿瘤细胞DNA损伤，激活DNA损伤修复，介导活化核因子(NF)-κB激活c-Met基因转录和HGF/c-Met信号通路相关蛋白的表达，增强细胞侵袭性，抑制细胞凋亡，增加放疗抵抗性〔18〕。此外，PI3K/AKT信号通路也参与了多种肿瘤的发生、发展和转归，与肿瘤的放疗抵抗机制有关。PI3K/AKT信号通路激活后可以抑制DNA双链断裂的主要修复机制，实现放射增敏作用；还可以作用于周期素D依赖蛋白激酶，调节细胞周期G1/S期转化，参与肿瘤细胞的增殖和细胞周期分布，抑制PI3K/AKT信号通路使细胞阻滞于G1期，防止放射治疗的再群体化，从而提高放疗敏感性〔19〕。研究证实〔20〕，mTOR抑制剂能够有效抑制PI3K/AKT信号通路活性，提高放疗敏感性。肿瘤干细胞的存在也是放疗抵抗的一个重要机制，肿瘤干细胞是肿瘤细胞中具有干细胞特性的异质性细胞，具有自我更新、多项分化潜能和不对称分裂等功能，尽管数量只占肿瘤组织1%左右，但在肿瘤侵袭、复发和转移中发挥重要作用〔21〕。肿瘤干细胞具有明显的放疗抵抗效应，促进DNA损伤修复、降低和清除活性氧、改变肿瘤微环境等多种途径来逃避放疗的杀伤作用。放疗后即使残留数量极少的肿瘤干细胞也能在放疗间隙期大量增殖，造成肿瘤的复发和转移，产生放疗抵抗〔22〕。

综上所述，尽管大分割适形放疗在晚期NSCLC患者中有较好的安全性和有效性，但仍有一定的放疗抵抗发生，可能与机体表达较高水平的miR-123和HGFR密切相关。研究不足是未能进一步阐述放疗抵抗与miR-123和HGFR表达之间的内在联系，以及miR-123和HGFR之间是否也存在紧密联系，miR-123和HGFR是否能作为增加放疗敏感性的干预靶点还需要进行深入探讨。