钱林华

(浙江大学医学院附属妇产科医院妇产科，浙江 杭州 310006)

卵巢癌是目前全球发病率较高的妇科恶性肿瘤疾病之一，该病的死亡率更是居于全世界妇科疾病第一位〔1～3〕。由于卵巢癌在发病初期缺乏特定的征象，因此该疾病在诊断时确诊非常之困难。即使卵巢癌病灶发现较早，其患者的术后生存率仍不理想，主要是由于手术只能切除肉眼可见的病灶，对于隐匿的转移灶则无作用。而且相当一部分的患者往往在确诊时病情就已经发展到了中晚期，从而失去了手术根除的机会。对于卵巢癌患者而言，放射线治疗成为卵巢癌重要的辅助手段之一。临床上卵巢癌的放疗效果比较有限，其主要原因在于卵巢癌细胞对放射线的敏感性较低〔4,5〕。据此可知，研究提高卵巢癌细胞放射敏感性的手段以提高其放射治疗的疗效意义重大。表皮型脂肪酸结合蛋白(FABP)-5能够通过脂肪酸代谢产物调控肿瘤细胞信号转导，促进细胞的增殖活化；研究发现在原发性肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等癌细胞异常增殖时该蛋白表达显著上调〔6～12〕。Ogawa等〔13〕报道，肿瘤细胞可以通过上调FABP-5基因表达，来钝化其射线敏感性，抵抗射线的杀伤作用。目前就卵巢癌癌细胞中FABP-5基因和蛋白相对表达水平与卵巢癌细胞放射敏感性关系的研究还比较缺乏。本研究旨在通过双向调控卵巢癌细胞中的FABP-5表达，探讨FABP-5表达与卵巢癌细胞放射敏感性的关系，为卵巢癌细胞的放射治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1实验细胞及仪器、实验动物 卵巢癌组织来自浙江大学医学附属妇产科医院2015年4月至2016年6月妇产科收治住院并接受手术切除的新鲜标本，且患者术前均未行放疗及化疗。术后于浙江省实验动物中心将每例所取癌及其周围的正常组织(癌缘5 cm)于液氮保存备用。病例标本均经病理学证实为卵巢癌。该研究经医院伦理委员会批准，患者皆知情同意。超净工作台(艺斯高贸易有限公司)，FABP-5兔抗人多克隆抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔多克隆抗体；GAPDH为小鼠抗人单克隆抗体，均来自艾康生物技术(杭州)有限公司。胎牛血清、磷酸缓冲液(PBS)、DMEM培养基、胰蛋白酶购于Hyclone公司；细胞培养箱(Heraeus Sepatech 公司生产)。Trizol试剂盒(Invitrogen生产)；十二烷基硫酸钠(SDS)蛋白上样缓冲液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测试试剂盒(北京益德益华生物有限公司)、TBS缓冲液(南京建成生物)。人卵巢癌SKOV3细胞购于中国医学科学院。30只雄性成年BALB/C裸鼠〔7～8周龄，裸鼠体重为(18±2)g〕由浙江省实验动物中心提供，室温25℃，湿度50%～80%，SPF环境下自由饮水和采食，生产许可证号为SCXK(浙)2008-0118。

1.3卵巢癌及癌旁组织中FABP-5 mRNA与蛋白的相对表达 采用实时聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹分别测定各个配对组织标本FABP-5基因和蛋白表达，重复3次。用Oligo7.6 Demo软件行引物设计，FABP-5正向：5'-TGAAGGAGCTAGGAGTGGGAA-3'，反向：5'-TGCACCATCTGTAAAGTTGCAG-3'，扩增长度212 bp；GAPDH正向：5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，反向：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'，扩增长度121 bp。提取总RNA后逆转录为cDNA，通过2-ΔΔCt分析法，按内参基因GAPDH测定FABP-5 mRNA相对表达水平。取配对卵巢癌样本，依据二喹啉甲酸(BCA)试剂盒提取并对组织中FABP-5蛋白浓度进行测定，将组织裂解后并将之稀释至同等的蛋白浓度后，5 min 100℃煮沸使蛋白变性，取蛋白40 μg/组，10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(70 V，30 min；100 V，90 min)后；转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(200 mA，3 h)；室温下5%的脱脂牛奶2 h(或4℃过夜)封闭；一抗1∶500，4℃过夜(或室温下孵育2 h)；含5%脱脂奶粉的PBS(TPBS)3次洗涤，PBS洗涤1次；后行蛋白免疫印迹反应，拍照记录后行软件图像分析，测定FABP-5蛋白质相对表达水平。

1.4卵巢癌SKOV3细胞体外培养建立实验模型及分组 将冻存的SKOV3人卵巢癌细胞于37℃的恒温水浴箱，30 s内行快速复苏。融化后即刻将细胞转至EP管内并向管中加入DMEM培养基，多次轻柔吹打，使细胞均匀分布，离心后弃去上清。复苏后的SKOV3细胞通过DMEM完全培养基调整细胞浓度为1×106/ml备用。将人卵巢癌SKOV3细胞随机平均分为3组:对照组(不实施任何基因转染)、FABP-5上调组(将pcDNA3.1-FABP-5进行基因转染)、FABP-5下调组(将FABP-5 siRNA进行基因转染)。

1.5采用电穿孔法进行基因转染 FABP-5 siRNA和pcDNA3.1-FABP-5分别由上海生工生物有限公司合成提供。取生长对数期人卵巢癌细胞行胰蛋白酶消化后收集细胞，通过羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HeBS)液(NaCl 140 mmol/L， KCl 5 mmol/L，葡萄糖6 mmol/L ，Na2HPO40.75 mmol/L ， Hepes 25 mmol/L)行重悬、计数后，调整细胞密度至5×106/ml，取200 μl细胞液/次加入电击杯，分别向对照组、上调组和下调组中分别加入4 μg生理盐水、pcDNA3.1-FABP-5、FABP-5 siRNA；电转后于室温下2 min静置，然后将3组SKOV3细胞分别置于3份6孔细胞培养板和96孔细胞培养板中(含2 ml细胞培养液)，于细胞培养箱中培养。取出3组细胞，弃去培养基后加入含800 μg/ml G418的培养基继续培养；定期细胞换液更换并筛选培养基，当细胞出现大量死亡，将G418的浓度减半后继续培养筛选；培养10～14 d后，显微镜下观察有稳定的抗性克隆后停药，对细胞进行扩大培养。

1.6RT-PCR和Western印迹检测细胞中FABP-5 mRNA和蛋白的表达 转染48 h后取3组细胞，方法同1.3。

1.7CCK-8试剂盒检测细胞的增殖 在SKOV3细胞基因转染后继续培养48 h，通过CCK-8法对卵巢癌细胞的增殖活化能力进行测定。转染48 h后，分别收集3组细胞后接种于96孔板上，每个处理设3个复孔；继续培养箱中细胞培养，细胞贴壁后再培养48 h，分别加 CCK-8试剂20 μl/孔后，振荡摇匀；将处理后的细胞于细胞培养箱中培养1.0～1.5 h后，之后取出细胞通过酶标仪测定OD490值。

1.8克隆形成实验观察各组SKOV细胞的放射敏感性 转染后48 h，3组细胞经消化、细胞计数后，分别接种于6孔培养板中；继续培养24～30 h，对3组细胞分别给予不同剂量Gy的单剂量照射(6 MV X射线，照射野为30×30 cm2，源皮距为100 cm)，放射后细胞静置培养14 d，通过1%的结晶紫固定液20 min固定后，显微镜下计数≥50个细胞克隆。通过Sigmaplot12.0软件行细胞存活曲线拟合，并对放射敏感性参数D0、外推数N值和照射2 Gy时细胞的存活率(SF2)进行计算。

1.9TUNEL检测细胞凋亡 转染后48 h，将细胞取出培养箱后测定各组中SKOV3细胞凋亡情况。首先，轻轻吹打使细胞均匀分布，细胞洗涤后，滴加50 μl原位末端标记反应混合液，于湿盒中37℃下孵育1 h，滴加POD2转化液50 μl，湿盒37℃孵育30 min，通过PBS(pH7.4)3次冲洗后，二氨基联苯胺(DAB)显色后，通过HE进行细胞复染后在显微镜下行图像分析，细胞核棕黄色的细胞为凋亡细胞，计数总细胞数及凋亡细胞数，并计算细胞凋亡率。

1.10检测调控FABP-5表达后X射线照射对卵巢癌细胞生长的影响 选取体重及日龄均相近的裸鼠30只，随机平均分为3组，对照组10只、FABP-5下调组10只和FABP-5上调组10只。取转染48 h后的各组细胞，通过胰酶消化重悬后，别接行相应组裸鼠右腋皮下0.5 cm处接种。裸鼠于通风、无菌、洁净的SPF级动物房饲养，接种约1 w，在裸鼠右腋接种区可见米粒大小的移植瘤；各组裸鼠麻醉满意后固定于解剖板上，放疗(20 Gy X射线照射)40 d后处死裸鼠，分离右腋肿瘤组织后，计算瘤块体积。

1.11统计学处理 采用SPSS17.0软件进行单因素方差(One-way ANOVA)分析和t检验。

2 结 果

2.1卵巢癌及癌旁组织中FABP-5 mRNA与蛋白的表达 卵巢癌组织和蛋白的相对表达水平明显较癌旁组织高(P<0.05)。见图1、表1。

2.2FABP-5 mRNA和蛋白的表达 与对照组相比,FABP-5下调组细胞FABP-5 mRNA和蛋白相对表达水平显著较低，FABP-5上调组SKOV3细胞FABP-5 mRNA和蛋白表达显著较高(P<0.05)。见图2、表2。

图1 卵巢癌及癌旁组织FABP-5 mRNA与蛋白表达

表1 卵巢癌及癌旁组织中FABP-5 mRNA与蛋白的表达

图2 转染48 h后各组FABP-5 mRNA和蛋白表达

表2 转染后FABP-5 mRNA和蛋白表达

与对照组比较：1)P<0.05；表3、表4同

2.3细胞的增殖 与对照组相比，FABP-5下调组癌细胞增殖水平显著降低(P<0.05)，而FABP-5上调组中卵巢癌细胞的增殖水平明显较FABP-5上调组升高(P<0.05)。见表3。

2.4卵巢癌细胞株SKOV3的放射敏感性 与对照组相比，FABP-5下调组细胞平均致死剂量D0、SF2和N值明显降低，FABP-5上调组细胞D0、SF2和N值显著升高(P<0.05)。见表4。

表3 转染后各时间点各组细胞增殖率的变化

表4 卵巢癌细胞株SKOV3的放射敏感性

2.5细胞凋亡 与对照组〔(25.4±1.2)%〕比较，FABP-5下调组卵巢癌SKOV3细胞凋亡率〔(58.6±0.9)%〕显著增加(P<0.05)；FABP-5上调组〔(12.3±0.7)%〕显著降低(P<0.05)。见图3。

图3 TUNEL法染色各组细胞凋亡(×200)

2.6各组联合X射线照射对卵巢癌细胞的生长抑制 FABP-5上调组瘤体平均体积显著大于FABP-5下调组(P<0.05)。20 Gy X射线照射后FABP-5下调组瘤体平均体积较照射前明显减小(P<0.05)；而FABP-5上调组裸鼠皮下种植瘤平均体积较照射前无明显变化(P>0.05)。见表5。

表5 X射线照射对卵巢癌细胞的作用

与FABP-5下调组比较：1)P<0.05，与照射前比较：2)P<0.05

3 讨 论

FABP家族是调控细胞内脂质代谢反应的一个蛋白家族，该家族与细胞代谢和机体炎症通路也密切相关。FABP能够高亲和性地和疏水性基团结合，如与长链脂肪酸等脂类物质进行可逆性结合。FABP家族的不同成员在机体内不同组织中差异性表达，其主要参与脂肪酸代谢〔14〕。FABP-5(E-FABP)主要来源于表皮细胞，近来研究发现在多种肿瘤细胞增殖过程中FABP-5基因显著上调，这提示FABP-5可能与多种肿瘤性疾病相关〔15～19〕。研究表明，其参与脂肪酸的胞内信号转导、基因表达调控及运输代谢等〔20〕；结合并转运维甲酸，对过氧化酶体增殖物激活受体(PPAR)β/δ进行活化，是细胞内源性的抗氧化物质，能够调节细胞的分化，促进增殖并抑制凋亡〔21〕。放疗对癌症细胞的干预机制主要是促进胞内产生高水平的活性氧(ROS)，后者可干扰DNA形成，降低肿瘤细胞活力〔22～25〕。而FABP-5是较好的内源性抗氧化性剂，可通过提高胞内抗氧化酶系统，捕捉或清除ROS，缓解ROS的毒杀作用，此系FABP-5影响卵巢癌细胞放射敏感性的重要原因〔26～29〕；通过抑制FABP-5表达，降低了其对ROS的捕捉能力，细胞内抗氧化状态下降，细胞凋亡增加〔30～32〕；细胞生存能力下降。据此可知，上调FABP-5的表达可能更大程度地降低癌细胞的放射敏感性，而下调FABP-5的表达则可能提高其放射敏感性，进而利于放疗的效果。

本试验结果提示双向调控FABP-5方法成功。人卵巢癌细胞的放射敏感性与FABP-5的表达高低关系密切，通过基因调控可以提高癌细胞的放射敏感性，增强放射治疗的疗效。