张放 孙怡芸 梁晓倩 杨爽

1976 年Friedenstein 等［1］首次证实骨髓中存在间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC），发现其可以作为壁龛细胞对造血干细胞发挥支持和辅助的作用。随着研究的深入，MSC 被证实为人体内重要的多能干细胞，主要存在于机体多种结缔组织，不仅具有低免疫原性的特点，还具有强大的免疫调节和多向分化功能［2］。近年来研究显示，MSC 是人体内成骨细胞的主要来源，可作为组织工程与修复医学的种子细胞，广泛应用于骨折修复、组织重建等再生医学领域［3，4］。然而，在实际应用中却发现，MSC移植后在体内定向分化效率较低，限制了MSC的临床应用［5］。如何进一步提高MSC 成骨分化效率，从而推动其临床应用，是当前研究的重点与热点。

MSC成骨分化受到多种炎症因子的调控［6］。白细胞介素23（interleukin-23,IL-23）属于IL-12家族中的一类促炎因子，主要由巨噬细胞和树突状细胞产生，发挥调控多种T细胞分化、增殖的功能［7］。已有研究发现，IL-12家族中多个因子对MSC的功能有重要的调控作用，但IL-23 对MSC 功能影响的研究较少［8］。在本研究中，我们拟在体外探讨IL-23对MSC成骨分化功能的调控作用，探索提高MSC分化效率的方法。

材料与方法

一、主要材料与仪器

H-DMEM 培养基、0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco，美国）；胎牛血清（杭州四季青，中国）；PBS 缓冲液、Percoll分离液、RIPA蛋白裂解液、蛋白定量试剂盒、氯仿、异丙醇、无水乙醇、多聚甲醛、焦碳酸二乙酯（DEPC）水（碧云天公司，中国）；地塞米松、β-磷酸甘油、抗坏血酸、氯化十六烷基吡啶（CPC）、茜素红（Sigma，美国）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性检测试剂盒（南京建成生物，中国）；IL-23（R&D，美国）；cDNA 逆转录试剂盒、SYBR Green 荧光定量试剂盒（TAKARA，日本）；Trizol提取液、全基因组表达谱芯片、Lipo 2000 转染试剂盒（Life，美国）；siRNA（吉玛基因，中国）；CD14-PE、CD45-FITC、HLA-DR-PE、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC 抗体（Meltenyi，德国）；离心管（15 ml、50 ml）、6孔板、96孔板、25 cm2培养瓶（Corning，美国），移液器（Eppendorf，德国）。生物安全柜、CO2恒温培养箱、酶标仪、低温高速离心机、Nano 分光光度计、PCR 仪（Thermo Fisher，美国）；Roche480 荧光定量PCR仪（Roche，美国）；倒置相差显微镜（Olympus，日本）；Hybridization Oven、Fluidics Station、GeneChip Scanner 3000（Affymetrix，美国），均用于芯片杂交与检测。

二、MSC体外分离、培养

8周龄的C57BL/6J小鼠购自辽宁省实验动物公共服务平台，本研究动物实验均符合动物实验伦理规范。所有小鼠均采取颈椎脱臼法处死，处死后解剖、切除双侧股骨，用10 ml PBS 缓冲液冲洗股骨骨髓腔，将骨髓冲入离心管中。骨髓样本用注射器缓慢加入等量Percoll分离液（1.073 g/ml）于液面上，以2 000 r/min 离心30 min。用巴氏吸管吸取中间白膜层并用PBS 缓冲液洗涤1 次，用含10%胎牛血清的H-DMEM 培养基重悬后以2×106cells/cm2的密度接种于25 cm2培养瓶中，放置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。72 h后洗去未贴壁细胞，此后每3 d换液1 次。当细胞达到80%～90%融合时，0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化传代，第2～3 代细胞用于进行下一步实验。

三、流式细胞术

MSC 分离培养3 d 后，常规消化收集细胞，通过计数法调整至浓度为1×106/ml，加入对应流式抗体10 μl，于室温下避光孵育30 min。随后用PBS 缓冲液清洗离心，通过流式细胞仪分析相应细胞表面标志物表达。

四、成骨分化诱导与刺激

MSC 以1×105cells/孔的密度接种于6 孔板，待细胞完全贴壁后换为成骨诱导培养基（含10%胎牛血清、50 mg/L 抗坏血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、10 nmol/L 地塞米松的H-DMEM），此后每3 d 换液1 次。实验组培养基中添加不同浓度IL-23（0、10、50、100 μg/L）持续刺激。

五、ALP活性测定

MSC诱导至10 d后，弃去上清，用PBS缓冲液轻轻清洗3 次，每孔加入RIPA 蛋白裂解液100 μl，冰上放置30 min。随后吸取蛋白裂解液，于4 ℃下以12 000 r/min 离心30 min。按照试剂盒方法配置ALP反应液，于96孔板中每孔加入反应液100 μl，同时加入蛋白上清30 μl，37 ℃孵育15 min。随后每孔加入显色液150 μl，充分混匀后通过酶标仪测吸光度。部分离心后的蛋白上清通过BCA 蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度，经蛋白标准化定量后样品的ALP活性单位为U·（g pro）-1·（15 min）-1。

六、茜素红染色与定量分析

MSC诱导至14 d后，弃去上清，用PBS缓冲液轻轻清洗3 次，随后用4%多聚甲醛溶液固定10 min。再次用PBS缓冲液清洗3次，吸干后每孔加入pH=4的1%茜素红染色液1 ml，室温孵育15 min。随后用PBS 缓冲液洗去非特异性染色与杂质，于倒置相差显微镜下选取中心区域拍照记录。拍照完成后，每孔加入1 ml 的10%CPC 萃取液，室温萃取1 h。混匀吸取200 μl 置入96 孔板中，于酶标仪下测定吸光度。

七、RNA提取与逆转录

MSC 刺激诱导10 d 后，用PBS 缓冲液轻轻清洗3 次。每孔加入1 ml Trizol，于冰上孵育5 min。将裂解液转移至EP管中并三氯甲烷200 μl，剧烈震荡混匀后静置5 min，随后12 000 r/min离心15 min。离心后吸取上层水相液体并转移入新的EP 管中。每管加入异丙醇500 μl，室温静置10 min 后12 000 r/min离心10 min。弃去上清，加入75%乙醇1 ml 洗涤RNA 沉淀，7 500 r/min 离心5 min。弃去上清，加入20 μl DEPC水。于Nanodrop紫外分光光度计下检测RNA浓度与纯度。按照逆转录试剂盒方法，每管加入逆转录试剂2 μl、RNA 8 μl，于37 ℃孵育15 min。

八、全基因组表达谱芯片

逆转录完成的cDNA 经过标记、芯片杂交、清洗、染色、扫描，收集数据后采用AGCC软件（Affymetrix，美国）进行分析，实验方法按照文献［6］报道方案进行。

九、荧光定量PCR

EP管中分别加入cDNA 2 μl、引物0.2 μl、DEPC水2.8 μl、SYBR Green 5 μl，总体积为10 μl，充分混匀后加入96孔板中。将PCR反应板置入Roche 480荧光定量PCR仪中进行PCR反应，通过软件分析数据基因相对表达量。内参GAPDH引物：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT、GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG；IL-23 引物：CTCAGGGACAACAGTCAGTTC、ACAGGGCTATCAGGGAGCA；Smad4 引物：CTCATGTGATCTATGCCCGTC、AGGTGATACAACTCGTTCGTAGT。

十、siRNA干扰

根据Smad4 序列设计3 个siRNA 序列，通过PCR法验证并选择干扰效率最高的siRNA序列。将20 pmol的siRNA溶于50 μl DMEM培养基中。另将1 μl Lipo 2000 转染试剂溶于50 μl DMEM 培养基中，混匀后于37 ℃孵育10 min。随后将两管试剂混匀孵育20 min，加入对应孔板中，于培养箱中孵育6 h。干扰后用PBS 缓冲液清洗3 次，加入新的培养基继续培养。Smad4 的干扰序列为GCCAGCAGCTTT-CACAGAA；对照（NC）序列为AGTTGGCTAATTCCGGCCATT。转染后分别为诱导组（成骨诱导、未转染序列）、NC组（成骨诱导并转染了NC序列）、siRNA 组（成骨诱导并转染了干扰序列），使用IL-23（100 μg/L）对诱导组、NC 组、siRNA 组持续刺激10 d，并进行茜素红及ALP实验。

十一、统计学分析

采用SPSS 13.0软件（IBM公司，美国）进行统计分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、MSC的形态与表型鉴定

MSCs呈梭型、成纤维细胞样生长。流式细胞学检测结果提示MSC 表型为CD14、CD45、HLA-DR 为阴性，CD29、CD44、CD105 为阳性，符合MSC 特征（图1）。

二、IL-23促进MSC成骨分化

MSC 分别在不同浓度IL-23 刺激下诱导分化。茜素红结果显示随着IL-23浓度增高（0～100 μg/L），茜素红染色深度逐渐增加，镜下可见MSC所形成的钙结节数量和面积均显著增加。通过CPC 萃取实验，我们发现随着IL-23浓度提高，其吸光度也相应增高，与未刺激组（0 μg/L）对比，差异具有统计学意义（P＜0.05），这与茜素红染色结果一致。碱性磷酸酶实验结果提示，随着IL-23浓度提高，MSC 中碱性磷酸酶活性明显上升，与未刺激组（0 μg/L）对比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这些结果均提示不同浓度的IL-23 均可以显著刺激MSC 成骨分化（图2）。

图1 MSC 的形态与表型鉴定 a：MSC 呈梭型集落样贴壁生长；b：流式细胞学分析结果提示MSC 为CD29、CD44、CD105 阳性，CD14、CD45、HLA-DR阴性，符合国际干细胞协会鉴定标准

三、IL-23上调Smad4表达

通过全基因组表达谱芯片，我们对不同浓度IL-23 刺激下成骨分化第10 天的MSC 全基因组进行检测，发现IL-23 刺激后MSC 基因表达谱出现显著异常，共有差异基因682 个。我们进一步对这些差异基因进行KEGG 信号通路分析，结果发现差异最显著的前三位通路分别是BMP/Smad 信号通路（P＜0.001）、MAPK 信号通路（P=0.001）和Hedgehog 信号通路（P=0.014）。我们对BMP/Smad 信号通路进行分析，发现富集到该通路的差异表达基因有11 个，其中表达变化最显著的基因为Smad4。我们进一步通过荧光定量PCR 对Smad4 的表达进行研究，结果提示随着IL-23 浓度升高（0～100 μg/L），Smad4 的表达也随之显著上调（P＜0.05），与芯片的结果一致（图3）。

四、干扰Smad4 表达可以抑制IL-23 促进MSC成骨分化

为了探讨Smad4 在IL-23 促进MSC 成骨分化中的作用，我们设计了siRNA 对MSC 进行转染，并使用IL-23（100 μg/L）对诱导组、NC 组、siRNA 组进行持续刺激。干扰MSC 的Smad4表达后，茜素红结果显示siRNA组染色较NC组明显变淡，镜下可见钙结节数量明显减少，且茜素红定量结果明显降低（P＜0.05）。此外，ALP 实验结果提示siRNA 组MSC ALP活性水平较NC 组明显降低，与茜素红实验结果一致（P＜0.05）（图4）。

图2 IL-23促进MSC成骨分化结果 a：茜素红染色结果示不同浓度IL-23刺激下茜素红染色逐渐加深；b：茜素红定量结果提示吸光度随着IL-23浓度增加而升高（与0 μg/L组对比，*P＜0.05）；c：ALP活性结果提示随着IL-23刺激浓度增高，MSC成骨分化后ALP活性明显增加（与0 μg/L组对比，*P＜0.05）

图3 IL-23上调Smad4表达结果 a：全基因表达谱芯片提示，IL-23刺激后MSC基因表达谱出现明显改变；b：荧光定量PCR结果提示Smad4表达量随着浓度上升而增高（与0 μg/L组对比，*P＜0.05）

图4 干扰Smad4表达后MSC成骨分化结果 在IL-23刺激情况下，干扰Smad4表达组的茜素红染色显著淡于单纯诱导组和NC转染组（a），茜素红定量结果（b）及ALP结果（c）提示干扰Smad4表达后MSC成骨分化能力显著下调（与诱导组对比，*P＜0.05）

讨 论

MSC 是人体内重要的多能干细胞，广泛存在于体内多种结缔组织中，以骨髓中含量最为丰富［9］。研究显示，MSC 主要三类功能：①支持造血。MSC可以作为骨髓微环境的壁龛细胞，一方面发挥支持造血干细胞的作用，另一方面可以分泌血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor, PDGF）等多种因子，从而调控造血干细胞的增殖、分化等功能，发挥对人体内造血系统的调控［10］。②免疫调节。MSC 可以通过接触抑制或者分泌IL-6、转化生长因子β（transforming growth factor,TGF-β）等炎性因子，对机体内T 细胞、B 细胞、NK 细胞等多种免疫细胞发挥调控作用，从而维持机体内免疫稳态［11-13］。③多向分化功能。MSC 为中胚层来源细胞，在体外诱导环境下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞［14］。新近研究指出，MSC 是人体内成骨细胞的主要来源之一，MSC 正常成骨分化能力是维持机体内骨代谢平衡的重要因素，而MSC成骨分化异常则会导致骨质疏松等骨代谢疾病［3］。因此，深入研究MSC 成骨分化的机制，有助于阐明机体骨骼生长发育的具体机制，同时有助于揭示骨代谢异常疾病的发病机制。此外，MSC 具有低免疫原性的特点，其低表达或不表达MHC I类分子，不表达MHC Ⅱ类分子，同时也不表达共刺激分子，不具备激发免疫应答的活性，具有良好的临床应用能力［4］。近年来，国内外学者已利用MSC 的成骨分化功能开展多项临床应用研究，证实MSC可以作为组织工程与再生医学的种子细胞，应用于骨折修复等疾病的治疗［15］。然而，部分学者的研究也发现，临床应用中MSC 的成骨分化受到多种细胞因子的影响和调控，其中炎性因子是影响体内MSC 成骨分化的主要因素之一［6］。研究证实炎性因子在体内作为“双刃剑”调控MSC的成骨分化：当炎性因子处在正常水平范围内，则可以调控MSC正常成骨分化，从而维持人体的骨代谢平衡；当体内炎性因子紊乱时，则会过度促进或抑制MSC 成骨分化，从而引起异位骨化或骨质疏松，导致疾病发生发展［16］。IL-23 是人体内重要的炎性因子，在体内发挥调控Th17细胞分化、增殖的功能［7］。研究发现，在强直性脊柱炎等疾病病人体内IL-23水平明显升高，与病人病理性成骨密切相关，提示IL-23水平升高可能参与正性促进成骨的作用，但IL-23具体如何调控成骨细胞主要来源——MSC 的分化，目前相关研究不多［17］。阐明IL-23 调控成骨分化的机制，将有助于阐明多种相关疾病骨代谢异常的发病机制。除此之外，骨折术后不愈合、脊柱手术术后不融合等也是困扰当前骨外科医师的重要并发症，这主要是由于术后局部炎性微环境紊乱等因素所引起［18］。已有部分学者将MSC 作为种子细胞移植治疗骨折不愈合、脊柱术后不融合等骨科疾病，但MSC 分化效率仍较低，阐明IL-23 调控MSC 成骨分化的机制，也将有助于提高MSC 的分化效率，促进和推动MSC的临床应用。

在本实验中，我们发现随着IL-23 浓度升高，茜素红染色与定量及ALP 结果均显著上升，这从定性和定量两方面均证实，IL-23可以显著促进MSC成骨分化，且这种效应随着浓度升高而提升。为了进一步探讨IL-23 调控MSC 成骨分化的机制，我们对MSC 的全基因表达谱进行分析，KEGG 信号通路分析结果发现BMP/Smad 信号通路差异最为明显，而其中成骨分化关键基因Smad4显著上调。Smad4是BMP/Smad信号通路关键的中介分子，主要通过与磷酸化的Smad2/3或Smad1/5/8结合，介导入核调控相关成骨基因的转录，从而促进MSC 的成骨分化［19］。在本研究中，我们进一步通过荧光定量PCR技术证实IL-23可以显著上调Smad4表达，且随着浓度增加而效果升高，这与茜素红及ALP 结果一致。此外，我们通过siRNA 干扰Smad4 表达，发现抑制MSC 的Smad4 表达后，最高浓度的IL-23（100 μg/L）的刺激也无法促进MSC 成骨分化，这一结果提示IL-23 确是通过Smad4 以调控MSC 成骨分化的。既往已有许多研究提示Smad4 是MSC 成骨分化的正性调控分子，而炎性因子可以通过上调Smad4 以促进MSC的成骨分化［20］。本研究结果证实，IL-23刺激正是通过上调MSC的Smad4表达，从而正性调控MSC的成骨分化。我们推测，在疾病模型中，可以通过抑制BMP/Smad 通路信号，从而阻断IL-23 引起的异位骨化；而在临床应用中，也可以通过IL-23对MSC进行预刺激，从而提高MSC 成骨分化能力，促进MSC 的临床骨修复功能。

综上所述，我们研究证实IL-23通过上调Smad4表达以促进MSC 成骨分化。但本研究中仍有一些不足，如IL-23在体内如何影响MSC功能，IL-23是否对MSC 成脂分化、免疫调节等功能发挥影响，IL-23对人来源的MSC 是否具有相同的作用？这些问题仍需在未来的研究中继续解答。