刘宇宏 曹慧琴 刘 卉 李晓勇

(延安大学附属医院免疫科，延安716000)

急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一种起源于淋巴细胞的B系或T系细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤性疾病[1]。根据我国白血病发病情况调查，ALL发病率约为0.67/10万[2]。在油田、污染区发病率明显高于全国发病率。ALL儿童期(0～9岁)为发病高峰，可占儿童白血病的70%以上[3]。已有研究表明神经菌毛素-1(Neuropilin-1,NRP-1)在白血病细胞中有表达，且ALL中NRP-1的表达较急性髓性白血病(Acute myloid leukemia,AML)中表达更多见[4-6]。

NRP-1最早是作为神经细胞导向调节因子受体被发现，是一类在脊椎动物中高度保守的分子量为130～140 kD的糖蛋白[7,8]。而近年来大量研究结果显示，人类的许多肿瘤组织上都有NRP-1的表达，包括前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤和胰腺癌，而在相应的正常组织中几乎不表达[9,10]。NRP-1作为血管生长因子的共受体，在肿瘤血管新生方面发挥着重要的调节作用[11]。目前，NRP-1对急性淋巴系白血病细胞生物学特性影响的相关研究较少。本研究旨在初步探讨NRP-1在急性淋巴细胞白血病CCRF-CEM细胞系中的表达及其对CCRF-CEM增殖迁移等生物学特性的影响。

1 材料与方法

1.1材料 RPMI1640培养液、DMEM 培养液、胎牛血清FBS(Gibco)；LB培养基(Solarbio)、Lipofec-tamine 2000(Thermo Fisher Scientific)；全自动细胞计数仪(Countstar-全自动细胞计数仪)；Transwell细胞培养小室(Corning)；高速离心机(Thermo Fisher Scientific)；生物显微镜(EVOS)；NRP-1抗体(GeneTex)。CCRF-CEM细胞和293T细胞购买于上海丰晖生物公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 CCRF-CEM细胞使用含10%FBS和1%双抗的RPMI1640培养液，293T细胞使用含10%FBS和1%双抗的高糖DMEM培养液。两种细胞均置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2.2NRP-1敲低细胞系构建及NRP-1抗体结合能力的鉴定 本研究采用四个质粒系统在293T细胞包装慢病毒颗粒，其中pLv-NRP-1/shRNA重组质粒由上海吉满生物公司构建。采用脂质体2000逆转染法在6孔板的293T细胞内共转染四个质粒(pLv-NRP-1/shRNA∶pMDLg/pRRE∶pVSV-G∶pRSV-Rev =2.0 μg∶1.0 μg∶0.6 μg∶0.4 μg，共4 μg总DNA)，脂质体2000使用量为10 μl。8～12 h后，移去旧培养液，更换为2 ml新鲜的DMEM完全培养液，放回37℃培养箱继续培养。转染48 h后收上清病毒，感染和筛选目的细胞，得到稳定株。使用Western blot 检测敲低细胞株NRP-1蛋白表达水平。

共聚焦显微镜检测NRP-1抗体与细胞的结合能力。在6孔板中培养野生型细胞和NRP-1敲低细胞，待细胞处于对数生长期时，加入荧光素BRITC标记的NRP-1抗体与细胞共同孵育30 min。收集细胞，PBS轻轻洗涤3次，除去游离和非特异性结合的抗体后做细胞滴片，滴片固定后共聚焦荧光显微镜下观察。

1.2.3细胞计数仪检测抑制NRP-1功能对细胞增殖的影响 取对数增长期的CCRF-CEM野生型细胞和NRP-1-shRNA-CCRF-CEM细胞分别稀释成2×105ml-1。将上述两种细胞分为3组：野生型CCRF-CEM细胞组+PBS组，野生型CCRF-NRP-1-shRNA-CCRF-CEM细胞组+PBS组和野生型CCRF-CEM细胞+NRP-1抗体组(分别记作PBS组，NRP-1-shRNA组和NRP-1 antibody组)。将上述3组细胞接种到12孔板，每组设4个时间点，每个时间点设3个复孔。分别在培养后6 h、12 h、24 h和48 h使用细胞计数仪测细胞数量，每次测量前均使用枪头吹打混匀。以PBS组为阴性对照，按照公式：抑制率=1-(阴性对照组细胞数-实验组细胞数)/阴性对照组细胞数，计算两种方法抑制NRP-1对细胞的增殖抑制率。

1.2.4Transwell检测抑制NRP-1功能对细胞迁移能力的影响 取对数增长期的CCRF-CEM野生型细胞和NRP-1-shRNA-CCRF-CEM细胞稀释成2×105ml-1并分为3组，分组同1.2.3(PBS组，NRP-1-shRNA组和NRP-1antibody组)，分别取100 μl加入Transwell上腔，下腔放入600 μl含有0.5%BSA的RPMI1640 培养液。于37℃,5%CO2条件下孵箱培养6 h和12 h后,收集下腔的细胞做细胞计数。

1.2.5流式细胞仪检测抑制NRP-1功能对细胞凋亡的影响 取对数生长期的野生型CCRF-CEM细胞和NRP-1-shRNA-CCRF-CEM细胞稀释成10×104ml-1，转移至6孔板中培养。分为3组(同1.2.3)并做相应处理。于37℃,5%CO2条件培养24 h和48 h后，收集细胞并用500 μl Binding buffer重悬细胞后，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染色液，混匀后室温孵育15 min。孵育完毕收集细胞用预冷500 μl PBS重悬后流式细胞仪检测。

1.2.6细胞计数仪检测抑制NRP-1功能对细胞耐药的影响 取对数生长期的CCRF-CEM野生型细胞和NRP-1-shRNA-CCRF-CEM细胞按1.2.3分为3组后，用含有不同浓度的表阿霉素(EPI)的培养基稀释成2×105ml-1，每组细胞的EPI终浓度分别为0.001、0.01、0.1、0.2、0.5、1 μg/ml。于37℃,5%CO2条件下培养24 h，使用细胞计数仪计算凋亡细胞和总细胞数。分别计算各组细胞在不同浓度EPI处理下的细胞凋亡率。

2 结果

2.1NRP-1敲低细胞株及NRP-1抗体结合能力的鉴定 Western blot结果(图1)显示，野生型细胞组在130 kD附近出现一明显特异性条带，与NRP-1理论分子量复合。而NRP-1-shRNA组的NRP-1蛋白表达量较野生型细胞明显降低。结果表明，成功构建NRP-1敲低的CCRF-CEM细胞株，且敲低效率较明显。

图2为共聚焦显微镜观察结果，在野生型细胞中，可见明显红色荧光在细胞表面集聚，而NRP-1敲低组则没有。结果表明，NRP-1抗体可在活体细胞中与NRP-1结合。

2.2细胞计数仪检测抑制NRP-1功能对细胞增殖的影响 以PBS组为阴性对照，根据公式计算出处理组的增殖抑制率并绘制统计图，结果如图3所示，NRP-1-shRNA组和NRP-1 antibody组的细胞在两个时间点的增殖均受到不同程度的抑制。且48 h的抑制率较12 h明显。结果提示，抑制NRP-1功能能显著抑制细胞的增殖。

2.3Transwell检测抑制NRP-1功能对细胞迁移能力的影响 用Transwell检测上诉两个处理组迁移能力的改变。结果如图4所示，NRP-1-shRNA组和NRP-1 antibody组的细胞迁移能力较PBS组都有不同程度的降低，下室细胞量与相应时间段的PBS阴性对照组有显著差异。

图1 Western blot检测NRP-1敲低细胞株NRP-1蛋白表达量Fig.1 NRP-1 protein expression of NRP-1 knockdown cell line by Western blot

图2 共聚焦显微镜分析NRP-1抗体与野生型细胞的结合能力Fig.2 Analyze binding ability of NRP-1 antibody to wild-type cells by confocal microscope

图3 NRP-1 抗体和NRP-1敲低后细胞增殖抑制率(n=3)Fig.3 Cell proliferation inhibition rate of different groups(n=3)Note: *.P<0.05，**.P<0.01.

2.4流式细胞仪检测抑制NRP-1功能对细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测NRP-1-shRNA组和NRP-1antibody组的细胞凋亡情况，结果如图5所示，左下象限(Q4)为正常活细胞，早期凋亡细胞在右下象限(Q2)，中晚期细胞则出现在右上象限(Q3)。NRP-1抗体组和NRP-1敲低组均能促进细胞凋亡，且凋亡多集中在Q2象限，为早期凋亡。细胞凋亡数与阴性对照PBS组对比，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.5抑制NRP-1功能对细胞耐药的影响 细胞对化疗药物的敏感性可以一定程度反映细胞的耐药程度，本实验通过计算加入化疗药物后的细胞凋亡率来评估NRP-1对细胞耐药的影响。结果如图6所示，当药物浓度过低或过高时，抑制NRP-1功能对细胞凋亡率的影响均不明显。而当化疗药物浓度在0.1～0.5 μg/ml时，两种方法抑制NRP-1功能均能增加细胞对化疗药物的敏感性，使细胞凋亡率增加。

图4 NRP-1 抗体和NRP-1敲低对细胞迁移的影响(n=3)Fig.4 Effects of NRP-1 antibody and NRP-1 knockdown on cell migration(n=3)Note: *.P<0.05，**.P<0.01.

图5 NRP-1 抗体和NRP-1敲低对细胞凋亡的影响(n=3)Fig.5 Effects of NRP-1 antibody and NRP-1 knockdown on cell apoptosis(n=3)

图6 NRP-1 抗体和NRP-1敲低对化疗药物耐药的影响(n=3)Fig.6 Effects of NRP-1 antibody and NRP-1 knockdown on chemotherapy drug resistance(n=3)Note: *.P<0.05，**.P<0.01.

3 讨论

儿童ALL治疗效果在近50年来稳步提高，5年无事件生存率达80%。但是难治复发仍是ALL治疗的难点，难治复发性ALL的预后差，生存期短[12，13]。儿童难治复发ALL的5年生存率在20%以下[14]。故寻找关键性的新作用靶点尤为重要。NRP-1在许多肿瘤上均有高表达，但是对白血病尤其是急性淋巴细胞白血病的相关研究较少。相关研究报道[4-6]，NRP-1在急性髓性白血病患者白血病细胞中有表达，但是NRP-1在血液系统及白血病细胞生物学特性的影响尚不清楚。本研究以急性淋巴细胞白血病CCRF-CEM细胞为研究对象，采用敲低NRP-1或NRP-1抗体两种方法抑制细胞NRP-1的功能，且与野生型细胞比较，从而探讨NRP-1对急性淋巴细胞的生物学特征的影响。

白血病细胞的生物学特点主要有细胞增殖异常，正常的凋亡程序失控使细胞凋亡率降低。通过抑制白血病细胞的增殖或促进其凋亡是白血病治疗的重要思路。本实验中，使用两种方法抑制NRP-1功能后，细胞的增殖能力均显著降低，而凋亡率则显著增加。说明NRP-1对CCRF-CEM的发生发展可能有促进作用。在抑制NRP-1功能后，流式细胞术结果显示，细胞发生凋亡，且多集中在早期凋亡。

白血病细胞的原发或继发耐药是导致ALL疗效差及复发率与死亡率高的重要原因[15]。近年来，探究ALL的耐药机制、如何克服或逆转耐药成为ALL的研究热点。王红梅等[16]的研究表明，沉默NRP-1基因后，人T细胞白血病Jurkat细胞株对化疗药物敏感性增加。在本研究中，在CCRF-CEM细胞中也得到相同结果。两种方法抑制NRP-1功能后，细胞对化疗药物的敏感性明显增加，NRP-1或可称为ALL的一个新的治疗靶点。

本研究在细胞水平上，初步探究了NRP-1对ALL的CCRF-CEM细胞株生物学特性的影响，为后期继续深入探讨NRP-1对其他ALL细胞株生物学特征的影响提供了参考，为继续研究NRP-1对ALL患者临床特征的影响提供了理论依据。