李淑艳 吴艳敏 刘 睿 张春晶 姚淑娟 衣同辉 师 岩

(齐齐哈尔医学院医学技术学院，齐齐哈尔161006)

内皮抑素(Endostatin,ES)是一种内源性血管生成抑制剂，其在抑制肿瘤形成和转移，促使肿瘤细胞凋亡等方面具有重要的研究价值。内皮抑素由184个氨基酸残基组成，通过特异性抑制内皮细胞增殖和血管生成达到抑制肿瘤形成、侵袭和转移的作用[1,2]。2005年，Robert等[3]证明内皮抑素活性区主要在N端的1～27位氨基酸上[3]。在前期工作中，本课题组截取1～27位氨基酸，并通过RGDRGD靶向连接改造形成人内皮抑素30肽(以下简称30肽)，研究表明，30肽可以更有效地杀伤肿瘤细胞，对肝癌细胞的侵袭、迁移和黏附等过程都具有较好的抑制效果[4,5]。但30肽对细胞凋亡相关信号通路的研究至今尚未明确报道，本文拟在前期工作基础上，研究30肽对肝癌细胞凋亡作用的影响，同时对凋亡相关蛋白和信号通路进行初步研究。

1 材料与方法

1.1材料 肝癌细胞株Bel-7402购自中科院细胞库，30肽按以往文献报道方法制备[6]。胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司，DMEM-H培养基购自Gibco公司。CCK-8试剂盒购自南京碧云天生物技术公司，Muse Annexin V Dead Cell Kit购自默克密理博公司，Hoechst33342荧光染料购自北京索莱宝生物科技有限公司。GADPH单抗、FoxM1单抗、MMP-2单抗和MMP-9单抗购自美国Santa Cruz公司，Caspase-3和Caspase-9活性测定试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.130肽对肝癌细胞株Bel-7402增殖抑制效果的测定 Bel-7402细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃ 5%CO2培养箱中培养。待细胞长至80%以上时用0.25%胰酶消化，用10%胎牛血清的DMEM-H培养基吹打成单细胞悬液后，按照0.5×104个/孔的密度将细胞接种于96孔板中，置37℃继续培养。将肝癌细胞株Bel-7402分为6组：对照组(0 μg/ml)、30肽组(终浓度分别为20、40、60、80和100 μg/ml，每组设置8个复孔)。培养24 h后，加入不同浓度的30肽，对照组加入相同体积培养基后继续培养24 h后，使用CCK-8试剂盒测定细胞存活率。按照试剂盒说明20 μl/孔加入CCK-8检测试剂，孵育3.5 h后在450 nm测定吸光度，以650 nm作为参考波长。通过计算细胞存活率来测定30肽对肝癌细胞株Bel-7402的半数抑制浓度IC50。

1.2.2Hoechst33342染色检测肝癌细胞株Bel-7402凋亡的形态学变化 取处于对数生长期的Bel-7402细胞，用0.25%胰酶消化后按1×106个/孔接种于6孔板中，待培养贴壁后，分组及30肽处理浓度同1.2.1。细胞培养24 h后，PBS溶液洗涤2次，加入4%甲醛溶液于-20℃固定25 min，取出后PBS溶液洗涤2次并晾干后，加入Hoechst33342染色10 min，PBS溶液洗涤3次后以340 nm波长激发，荧光显微镜下观察细胞形态。

1.2.3流式细胞术检测30肽对肝癌细胞株Bel-7402凋亡的影响 按照肝癌细胞株Bel-7402凋亡形态学实验中所述方法进行细胞培养和收集。将细胞用不含胎牛血清的DMEM培养基按50 μl/孔重悬。按照Muse Annexin V Dead Cell Kit检测试剂盒的操作流程进行染色，最后使用Muse细胞分析仪进行样品检测。按照试剂盒说明将双参数散点图进行分相分析，以获得各实验组中正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞的比例。

1.2.430肽对FoxM1、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响 根据IC50测定结果，将终浓度为43.07 μg/ml的30肽加入到铺满Bel-7402细胞的6孔板中，分别于0 h、12 h、24 h和36 h收集各组的细胞并加入预冷的细胞裂解液。裂解后收集细胞裂解液以12 000 g，4℃离心10 min，取上清液进行检测。首先应用DC Protein Assay Kit进行样品蛋白质浓度测定后，将提取物按30 μg/孔进行SDS-PAGE凝胶电泳。转膜，封闭液中室温封闭1.5 h，加入相应稀释倍数的一抗，孵育过夜，洗膜后，加入1∶5 000的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育3 h，曝光胶片后用Image J软件进行分析。

1.2.530肽对Caspase-3、Caspase-9酶活性的影响 按实验方法1.2.4，将终浓度为43.07 μg/ml的30肽加入到铺满Bel-7402细胞的6孔板中，分别于0 h、12 h、24 h和36 h收集各组的细胞并加入预冷的细胞裂解液收集蛋白，取50 μg全细胞裂解液蛋白，按试剂盒说明书要求分别加入25 μmol/L Caspases-3底物(DEVD-pNA)和Caspase-9底物(IETD-pNA)，37℃下孵育2 h后，使用酶标仪测定405 nm吸光度。

2 结果

2.130肽对肝癌细胞株Bel-7402增殖的抑制作用 CCK-8检测试剂含有WST-8，在细胞线粒体脱氢酶作用下生成黄色可溶于水的化合物formazan。生成的formazan数量与存活细胞数量呈正比。通过酶标仪测定表明30肽能抑制Bel-7402细胞的增殖，并呈剂量依赖性。应用线性回归分析计算出30肽对Bel-7402细胞的半数抑制浓度IC50为43.07 μg/ml。见图1。

2.2Hoechst33342染色检测30肽作用后Bel-7402细胞的形态学变化 Bel-7402细胞接种于6孔板，培养24 h后在倒置显微镜下观察，可见对照组细胞数量较多，细胞间连接紧密，Hoechst33342染色后观察可见细胞核大小均一。不同浓度的30肽(0、20、40、60、80、和100 μg/ml)作用于Bel-7402细胞24 h后，随着30肽浓度的增加，各组细胞数量逐渐减少，细胞边界收缩变圆，细胞核大小不一，出现核内部分染色质断裂、皱缩，形成团块现象。见图2。

图1 内皮抑素30肽对Bel-7402细胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of endostatin peptide 30 on proliferation of Bel-7402 cells

2.3流式细胞术检测Bel-7402细胞凋亡率 收集各浓度30肽(0、20、40、60、80和100 μg/ml)作用24 h后的Bel-7402细胞进行流式细胞术检测。0 μg/ml 组为对照组，结果表明：从20 μg/ml开始，30肽就对Bel-7402细胞产生了明显的杀伤作用，细胞凋亡率依次为：0%、(18.40±2.0)%、(37.66±2.5)%、(69.22±2.0)%、(72.76±2.1)%、(86.84±2.3)%，可见，随着30肽浓度的增高，细胞存活数量逐渐减少，凋亡数量逐渐增加，呈剂量依赖性，趋势和Hoechst33342染色结果一致。各处理组凋亡率与对照组(0 μg/ml组)比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图2 30肽作用24 h后Bel-7402细胞的形态学改变和Hoechst33342染色结果(×400)Fig.2 Morphological changes and Hoechst33342 staining results of Bel-7402 cells 24 h after peptide 30 treatment(×400)Note:In each group,the left side is observed under an inverted microscope,and the right side is the staining result of Hoechst33342.

2.430肽对FoxM1、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响 结果如图4、表1所示：根据IC50测定结果，将终浓度为43.07 μg/ml的30肽作用于Bel-7402细胞后， FoxM1、 MMP-2和MMP-9蛋白表达量随作用时间的延长而下调。当作用时间达到24 h后，30肽作用组和对照组(0 h组)比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 不同浓度30肽作用Bel-7402细胞24 h后的流式细胞术检测结果Fig.3 Flow cytometry results of Bel-7402 cells treated with peptide 30 at different concentrations for 24 h

图4 30肽对Bel-7402细胞FoxM1、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响Fig.4 Effect of peptide 30 on expression of FoxM1,MMP-2 and MMP-9 in Bel-7402 cells

Gray intensity ratioTime0 h12 h24 h36 hFoxM1/GAPDH4.40±0.213.24±0.862.30±0.541)2.24±0.741)MMP-2/GAPDH1.63±0.421.14±0.540.68±0.391)0.58±0.421)MMP-9/GAPDH1.24±0.170.86±0.190.72±0.191)0.67±0.161)

Note：1)P<0.05 vs 0 h group.

GroupsCaspase-312 h24 h36 hCaspase-912 h24 h36 hPeptide 301.06±0.081)1.21±0.121)1.35±0.091)1.12±0.081)1.43±0.111)1.63±0.031)Control0.43±0.110.41±0.070.39±0.050.51±0.020.52±0.070.46±0.01

Note：1)P<0.05 vs control group.

2.530肽对Caspase-3、Caspase-9酶活性的影响 测定405 nm的吸光度，对Caspase-3和Caspase-9酶活性进行分析。实验结果表明：随着时间的延长，30肽作用后各组Caspase-3和Caspase-9酶活性增高，与对照组(0 h组)相比，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。

3 讨论

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一[7,8]，其发病率及死亡率呈逐年上升趋势[9]。目前对于肝癌的治疗主要以传统的放疗和化疗为主，但由于肝癌细胞对大多数的放化疗药物不敏感，导致传统疗法收效甚微[10]。因此，寻找新的高效低毒的小分子肽是临床上治疗肝癌的关键。

内皮抑素30肽是通过基因工程技术对内皮抑素改构修饰形成的小分子肽，能显著抑制肿瘤组织新生血管的生成，抑制肿瘤细胞的生长与增殖，还能通过与整合素结合发挥去整合素效应，进而有效地抑制肿瘤细胞的侵袭与转移[4]。

本研究中，内皮抑素30肽能够显著抑制人肝癌Bel-7402细胞的活力，作用24 h抑制作用最明显，半数抑制浓度IC50为43.07 μg/ml，并且呈剂量依赖性。

定性实验：Hoechst33342染色实验检测30肽作用后Bel-7402细胞的形态学变化，发现不同浓度的30肽作用于Bel-7402细胞后，随着30肽浓度的增加，各组细胞数量逐渐减少，细胞边界收缩变圆，细胞核大小不一，出现核内部分染色质断裂、皱缩，形成团块现象。定量实验：流式细胞术检测30肽对Bel-7402凋亡率，发现30肽作用组细胞凋亡率逐渐增加，呈剂量依赖性。因此，本研究通过Hoechst33342染色和流式细胞术检测，确定了30肽可以有效促进肝癌Bel-7402细胞凋亡。

叉头框蛋白M1(Forkhead box M1，FoxM1)于2007年首次被发现，属于Fox转录因子家族[11]。FoxM1在胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和肝癌等多种人类癌症细胞中过量表达，与癌症晚期、癌细胞转移、高增殖、化疗耐药性以及预后不良等密切相关，还参与多种癌症相关基因的表达及信号转导途径。因此，FoxM1被认为是抗癌药物治疗与干预的重要药靶与标记，在肿瘤组织的增殖、凋亡以及器官发育等多方面具有重要作用[12,13]。Marianna等[14]研究报道，靶向FoxM1的多肽可以有效促进肿瘤细胞凋亡[15]。相对于肿瘤细胞信号转导通路而言，FoxM1基因可能是通过GRB7/ERK/FOXM1等信号通路影响细胞凋亡，并且在此信号通路激活过程中，活化的ERK使AP-1蛋白磷酸化，最终使MMP-2、MMP-9的表达量上升[16]；活化的FOXM1也可以使细胞中MMP-2、MMP-9指标升高[17]。

本研究中，30肽作用组FoxM1、MMP-2和MMP-9蛋白表达量随30肽作用时间的延长而下调，表明30肽可能是通过GRB7/ERK/FOXM1信号通路抑制FoxM1基因表达，进而抑制下游MMP-2和MMP-9表达，诱导肝癌细胞Bel-7402凋亡。

Caspase蛋白酶家族在细胞凋亡中起到重要作用。其中Caspase-3、Caspase-9的激活与细胞的线粒体通路凋亡密切相关[18]，本研究测定了30肽对Bel-7402细胞Caspase-3、Caspase-9酶活性的影响，结果表明，随着30肽作用时间的延长，各组Caspase-3和Caspase-9酶活性均明显增高，可以确定线粒体通路在30肽诱导肝癌Bel-7402细胞凋亡中也具有重要意义。

综上所述，30肽能有效抑制肝癌Bel-7402细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡。其机制与30肽抑制FoxM1、MMP-2和MMP-9基因表达，激活Caspase-3、Caspase-9酶活性有关。本研究进一步阐明了30肽抗肿瘤的分子机制，为30肽应用于肝癌的治疗提供了新的实验依据，为临床抗肿瘤多肽生物技术药物的研发提供了新的线索。