冷 伟 刘春莹 尚 乘 陈明霞

(陕西中医药大学第一临床医学院,咸阳712000)

糖尿病肾病是糖尿病常见的慢性并发症之一，是导致终末期肾病的主要原因。据统计截至2015年，全球约有4.15亿糖尿病患者，其中90%以上为2型糖尿病，推测每年有150～500万人因糖尿病死亡，而糖尿病肾病是导致糖尿病患者死亡的主要原因[1]。在1型糖尿病中糖尿病肾病的发病率为33%～40%，而2型糖尿病中发病率为20%～25%[2]。因此延缓糖尿病肾病的发生和发展具有重要的意义。糖尿病肾病发病机制与糖代谢紊乱、氧化应激、免疫调节和血流动力学异常等因素密切相关[3]。因此天然降血糖血脂、抗氧化化合物可以作为治疗糖尿病肾病的候选药物[4]。连翘苷是植物连翘干燥果实中的提取物，在生活中常用于清热解毒、风热感冒的治疗。研究发现连翘苷具有抑制炎症反应、抗病毒、抗氧化应激和细胞凋亡等多种药理学作用[5,6]。Kong等[7]实验显示，连翘苷能抑制肿瘤坏死因子的激活，改善肥胖组织的炎症变化和胰岛素抵抗性。据报道，连翘苷能抑制高糖诱导的肝细胞脂肪积累，是腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活剂，具有预防和治疗肥胖的作用[8]。然而连翘苷对糖尿病肾病肾组织是否具有保护作用尚未见报道。本实验旨在探讨连翘苷对糖尿病肾病肾损伤的保护作用，为连翘苷在糖尿病肾病中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 连翘苷(纯度>98%，CAS：478-41-2)购自四川维克奇生物公司；SD大鼠购自北京维通利华实验动物公司；苏木伊红染色试剂盒(HE)购自杭州昊鑫生物公司；大鼠尿白蛋白酶联免疫分析(ELISA)试剂盒购自上海卡奴生物公司；大鼠IL-4、IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、MCP-1 ELISA试剂盒购自武汉艾美捷科技公司；免疫组化试剂盒购自南京建成生物工程研究所；抗体TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin购自美国Abcam公司；SOD、CAT、GPx、MDA、GSSG、GSH检测试剂盒购自碧云天生物。

1.2方法

1.2.1糖尿病肾病大鼠模型的复制 大鼠适应环境1周后，以高糖高脂饲料(10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、67.5%常规饲料)饲养1个月，诱导出胰岛素抵抗。腹腔注射25 mg/kg链脲佐菌素，72 h后空腹状态下大鼠血糖浓度高于16.7 mmol/L为造模成功。

1.2.2大鼠的分组及给药 将糖尿病肾病大鼠随机分为4组：糖尿病肾病组，连翘苷5 mg/kg组，连翘苷10 mg/kg组，连翘苷20 mg/kg组，另外设置正常对照组。造模成功后1 d，连翘苷5、10、20 mg/kg组大鼠采用灌胃给药的方式给予连翘苷；糖尿病肾病组大鼠给予等量生理盐水。每天1次，连续2周后，检测相应指标。

1.2.3苏木伊红染色 SD大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后，用生理盐水灌洗至肾脏变白。摘取肾脏液氮速冻后置于-80℃保存。取大鼠肾组织，4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋切片。二甲苯脱蜡后，梯度降低的乙醇脱二甲苯，苏木伊红染色3 min，自来水洗1 min，1%氨水返蓝，自来水洗1 min。95%乙醇1 min，伊红染色30 s，80%乙醇脱水30 s，90%乙醇脱水30 s，95%乙醇脱水1 min，无水乙醇脱水1 min，二甲苯2 min后，更换新二甲苯2 min；中性树脂封片。倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.4生化指标的检测 收集24 h尿液，4 000 g离心10 min，按照试剂盒说明书检测尿白蛋白的含量。

大鼠麻醉后，眼眶取血，室温静置2 h，离心收集上清，使用全自动生化仪检测血液尿素氮、尿素、肌酐的含量。取大鼠肾组织，预冷PBS洗3次，使用眼科剪剪碎后，低温匀浆，16 000 g离心10 min后，收集上清液。使用领联茴香胺核黄素光化学反应法检测大鼠肾组织中总SOD的活性；采用还原型谷胱甘肽消耗法检测大鼠肾组织中GPx的活性；使用过氧化氢分解法检测大鼠肾组织中CAT的活性；MDA采用硫代硫酸钠法检测；按照试剂说明书检测大鼠肾组织中GSH和GSSG的含量。

1.2.5酶联免疫吸附试验检测大鼠肾组织中炎症因子的含量 取大鼠肾组织，预冷PBS洗3次，使用眼科剪剪碎后，低温匀浆，16 000 g离心10 min后，收集上清液，生理盐水稀释后备用。取100 μl样品至反应孔，设置标准样品孔和空白孔，加检测抗体，37℃孵育90 min，洗涤液洗5次，生物素标记的辣根过氧化物酶，37℃温育30 min，洗涤液洗5次；加显色液，37℃避光反应15 min，加终止液，检测波长450 nm处吸收值。每个标本测3个复孔，测定值为3个复孔的平均值。

1.2.6免疫组化 取石蜡切片，常规脱蜡至水。3%过氧化氢于室温下孵育10 min；切片置于盛枸橼酸盐缓冲液的容器中，95℃左右持续10 min后室温冷却；PBS洗3次，5%BSA封闭液37℃孵育30 min；滴加一抗，37℃孵育1 h；PBS洗3次；加生物素标记的抗体，37℃孵育30 min；PBS洗3 次，加SABC，37℃孵育30 min；PBS洗3次，显微镜下显色并控制反应时间，苏木素复染后脱水透明，中性树胶封片。使用软件Image J分析阳性细胞占比。

1.3统计学分析 使用统计学软件SPSS18.0分析实验数据。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1连翘苷对糖尿病肾病大鼠肾组织损伤的影响 实验结果显示，对照组肾小球上皮细胞排列整齐；糖尿病肾病组肾小球体积增大，系膜区弥漫性增宽，细胞外基质增多，基底膜增厚，肾间质有炎症细胞浸润。连翘苷治疗后，肾小球的体积，基底膜厚度和炎症细胞浸润明显减轻。

2.2连翘苷对糖尿病肾病大鼠肾功能指标的影响 糖尿病肾病组与对照组相比，血液中尿素氮、肌酐、尿酸和24 h尿液中尿白蛋白的含量显著增加；糖尿病肾病大鼠经连翘苷作用后，结果显示尿血液中尿素氮、肌酐、尿酸和24 h尿液中尿白蛋白的含量显著减少，作用效果具有连翘苷剂量依赖效应，见图2。

2.3连翘苷对糖尿病肾病大鼠炎症反应的影响 实验结果显示，糖尿病肾病组与对照组相比，肾组织中IL-4、IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、MCP-1的含量显著升高；糖尿病肾病大鼠经连翘苷作用后，肾组织中IL-4、IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、MCP-1的含量显著降低，且作用效果具有连翘苷剂量依赖效应，见图3。

图1 苏木伊红染色检测连翘苷对糖尿病肾病大鼠肾组织损伤(×200)Fig.1 Effects of phillyrin on damage of forsythia glycos-ide to renal tissue in diabetic nephropathy rats was detected by hematoxylin and eosin staining(×200)

图2 连翘苷对糖尿病肾病大鼠肾功能指标的影响Fig.2 Effects of phillyrin on renal function in diabetic nephropathy ratsNote: Compared with Ctrl group，**.P<0.01；compared with DN group，##.P<0.01.

图3 酶联免疫吸附试验检测连翘苷对糖尿病肾病大鼠炎症因子的影响Fig.3 Effect of forsythia glycoside on inflammatory factors in diabetic nephropathy rats was examined by enzyme-linked immunosorbent assayNote: Compared with Ctrl group，**.P<0.01；compared with DN group，##.P<0.01.

图4 免疫组化检测连翘苷对糖尿病肾病大鼠肾组织中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin蛋白表达水平的影响(×400)Fig.4 Immunohistochemistry was used to determine effect of phillyrin on expression level of TGF-β1,Col-Ⅳ,Fibronectin related proteins in renal tissue of diabetic nephropathy rats(×400)Note: Compared with ctrl group，**.P<0.01；compared with DN group，##.P<0.01.

图5 连翘苷对糖尿病肾病大鼠氧化应激指标的影响Fig.5 Effects of phillyrin on oxidative stress in diabetic nephropathy ratsNote: Compared with Ctrl group，**.P<0.01；compared with DN group，##.P<0.01.

2.4连翘苷对糖尿病肾病大鼠TGF-β1通路相关蛋白表达水平的影响 实验结果显示，糖尿病肾病组与对照组相比，肾组织中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin的表达水平显著升高；糖尿病肾病大鼠经连翘苷处理后，肾组织中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin的表达水平显著降低，且其作用效果具有连翘苷剂量依赖效应，见图4。

2.5连翘苷对糖尿病肾病大鼠氧化应激反应的影响 实验结果显示，与对照组相比，糖尿病肾病组大鼠肾组织中总SOD、CAT、GPx的活性均显著降低，MDA、GSSG的含量显著增加，GSH的含量显著降低；糖尿病肾病大鼠经连翘苷作用后，肾组织中总SOD、CAT、GPx的活性均显著升高，MDA、GSSG的含量显著降低，GSH的含量显著升高，且其作用效果具有连翘苷剂量依赖效应，见图5。

3 讨论

随着生活质量的提高，我国糖尿病的发病率呈上升的趋势。糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症，目前治疗效果只能在一定程度上控制其发展，缓解肾功能衰竭。研究发现降血压、降血脂、抗血液凝聚药物和抗氧化剂对糖尿病肾病患者肾脏具有保护作用[3]。许多重要提取物具有降血糖血脂和抗氧化等作用，Bo等[9]发现姜黄素通过抑制脂质累积和氧化应激，对糖尿病肾病具有保护作用。连翘苷有抑制脂肪累积和抑制炎症反应的作用，在此基础上本实验通过高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素诱导糖尿病肾病大鼠模型，探讨连翘苷对DN大鼠肾脏的保护作用。

本实验结果显示连翘苷能有效缓解DN大鼠肾组织病理损伤，糖尿病肾病肾组织损伤与多种因素密切相关，如血流动力学改变、氧化应激、炎症反应、细胞外基质的变化等。接下来从上述因素中探讨连翘苷对DN大鼠中炎症反应、氧化应激等因素的影响。

糖尿病肾病是糖尿病患者常见的微血管并发症，典型的症状有尿白蛋白含量逐渐上升。本研究显示，连翘苷治疗糖尿病肾病大鼠后，大鼠血液中尿素氮、肌酐、尿酸的含量均显著降低。尿酸是体内嘌呤代谢的终末产物，由肾脏排出，反映肾功能；肌酐反映肾脏的滤过能力；尿素氮也是肾功能观测指标。肾小球和肾小管发生病变时，会出现尿白蛋白含量增加。实验结果表明，连翘苷缓解糖尿病对大鼠肾功能的影响。

炎症反应在DN的发展过程中发挥着重要的作用。本实验结果显示，连翘苷处理DN大鼠后，大鼠肾组织中IL-4、IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、MCP-1的含量显著降低。MCP-1是趋化因子家族中的重要成员，参与细胞外基质积累，能激活核因子κB刺激炎症因子的释放[10]。研究发现，IL-6和IL-18促使肾组织肾小球基底膜增厚，增加血管的通透性。据报道，连翘苷通过抑制核因子κB的活性，缓解脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠的炎症反应[11]。Yang等[12]在斑马鱼中也发现连翘苷具有抑制炎症反应的作用。本实验结果与上述研究一致，表明连翘苷抑制糖尿病肾病大鼠的炎症反应。

TGF-β可以由多种细胞分泌，参与细胞生长、分化、免疫功能、组织修复和胚胎发育等过程的调节，TGF-β三种亚型中TGF-β1对糖尿病并发症起主要的调节作用。在糖尿病患者和糖尿病动物模型中均发现TGF-β1的表达水平上调；临床研究显示抗TGF-β1抗体对糖尿病肾病患者有治疗作用[13]。本文研究结果显示，糖尿病肾病大鼠中TGF-β1的表达水平明显高于对照组；糖尿病肾病大鼠经连翘苷处理后，大鼠肾组织中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin的表达水平显著降低。Col-Ⅳ、Fibronectin是细胞外基质中的主要蛋白，细胞外基质的积累是促进肾小球肥大的主要因素[14]。研究发现抑制TGF-β1的表达能有效抑制Col-Ⅳ、Fibronectin的积累。Wang等[15]实验也证实，抑制TGF-β1通路能改善糖尿病肾病。连翘苷抑制DN大鼠肾组织中TGF-β1的表达水平，提示其作用与TGF-β1表达变化相关，而连翘苷具体的作用机制仍需要深入研究。

氧化应激是指机体受到有害刺激时氧化与抗氧化系统失衡。研究发现血糖含量过高后，使ROS的含量上升，破坏肾小球基底膜的极性使肾小球滤过性遭破坏，另外通过改变血流动力学和细胞外基质，促进糖尿病肾病的发展[16]。本研究显示，糖尿病肾病大鼠经连翘苷处理后，肾组织总SOD、CAT、GPx的活性均显著升高，MDA、GSSG的含量显著降低，GSH的含量显著升高。SOD、CAT和GPx是抗氧化、清除氧自由基的关键蛋白酶。研究发现，连翘苷能抑制过氧化氢诱导的神经细胞PC12的氧化应激和细胞凋亡，对细胞具有保护作用[5]。与本实验结果一致，表明连翘苷抑制糖尿病肾病大鼠的氧化应激反应。

糖尿病肾病大鼠经连翘苷处理后，肾组织病变明显缓解，肾功能有效提高，炎症反应和氧化应激反应明显缓解，大鼠肾组织中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin的表达水平显著降低。综上所述，连翘苷对糖尿病肾病大鼠具有保护作用，其作用机制与抑制TGF-β1的表达相关。