魏 萍 陈志斌 王春娥 李大治 陈可强

(福建中医药大学，福州350102)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是典型的阻塞性肺疾病，COPD会常伴有呼吸问题和气流阻塞，主要表现为呼吸短促、咳痰现象[1,2]。吸烟、空气污染和扬尘是造成COPD的主要原因[3]。作为一种重要的公众健康问题，COPD已经成为中国第三大死亡原因[4]。流行统计学数据显示，2015年中国COPD患病率为8.6%，约有999万患者患有COPD[5,6]。虽然西药在COPD的治疗中取得了一定治疗效果，但是具有为患者带来极大痛苦的副作用。而中药在COPD的治疗过程中具有疗效好，副作用小等特点，越来越受到重视。槲皮素(Quercetin，QT)是一种天然饮食类黄酮，富含于水果、蔬菜、绿茶和一些合成药物之中，具有较低毒性[7]。近年来，QT广泛的药理作用，包括抗氧化、抗炎、抗癌引起大量研究者关注[8]。在COPD发病过程中，IL-6和TNF-α等可通过破坏小气道和肺泡组织结构与功能导致患者肺功能下降[9,10]。然而QT是否对慢性肺阻塞性肺病有保护作用及分子调控机制尚不清楚。目前主要治疗手段为控烟、氧疗、支气管扩张剂和呼吸兴奋剂等，虽然临床疗效也有所提高，但是目前高发病率和高死亡率的现状并无明显改善[11,12]。积极探索COPD病理机制，对发现有效治疗靶点有十分重要的意义。本研究根据前人科研成果，探究QT对大鼠COPD模型的治疗效果和作用机制，期望为COPD的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 Click-iT®Plus TUNEL assay试剂盒(货号：C10618)购自Invitrogen公司。苏木素伊红(HE)染色试剂盒(货号：C0105)购自碧云天。Masson Stain Kit Masson染色试剂盒(货号：60532ES58)购自上海翊圣生物科技有限公司。Caspase-3(货号：ab13847)、Caspase-9(货号：ab202068)、TGF-β1(货号：ab64715)、α-SMA(货号：ab5694)、GAPDH(货号：1056)一抗购自美国Abcam公司，HRP标记的山羊抗小鼠二抗购自美国Santa Cruz公司。IL-6(货号：E-EL-R0015c)、TNF-α(E-EL-R0019)、IL-10(E-EL-R0016)和ELISA试剂盒购自Elabscience。AniRes2005动物肺功能分析系统购自北京贝兰博科技有限公司。

1.1.2仪器 PCR仪、电泳仪及半干转膜仪均购自美国伯乐公司。Gel View 6000化学发光凝胶成像系统购自广州云星仪器有限公司。Multiskan GO酶标仪购自Thermo。

1.2方法

1.2.1应用熏香烟联合气道内滴注脂多糖(LPS)的方法造成大鼠COPD模型 经学校实验动物伦理委员会审查同意后，选择40只3周龄SPF级别SD大鼠,购自北京维通利华实验动物公司，许可证号为SCXK (京) 2014-0001。随机分为四组，分别设置健康对照组(Healthy Ctrl组)、COPD模型组(COPD组)、QT单独作用组(QT组)和COPD+QT组。大鼠适应性饲养一周后给予香烟联合气道内滴注LPS方法进行造模：将各模型组大鼠置于自制有机玻璃熏烟箱中，盖上盖子；将黄果树牌香烟插入点烟盒，然后打开微型真空泵，泵入烟雾。每次点烟20支，熏烟1 h，连续进行3个月。大鼠经气道内滴注LPS(1 mg/kg)。空白大鼠只进行生理盐水滴注，不做烟熏处理，建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型后进行相关实验。用药治疗：口服给药QT连续四周(50 mg/kg)后，进行相关实验。

1.2.2大鼠基本指标检测 QT治疗结束后样本提取前，称量大鼠体重。检测大鼠肺功能：大鼠禁食12 h后，用2%戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉，将大鼠仰卧固定，剪开颈部皮肤及肌肉进行气管插管，用AniRes2005动物肺功能分析系统检测大鼠肺功能。通过一秒用力呼吸气容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)比率对大鼠肺功能进行评价。

1.2.3HE染色 取左肺用生理盐水充分冲洗，再用10%中性福尔马林固定，切片经3次二甲苯脱蜡，每次时间分别为15 min、15 min、10 min；梯度酒精脱苯，分别用100%、90%、80%、70%的酒精脱苯10 min；蒸馏水冲洗5 min，2次；苏木素染核15 min，蒸馏水冲洗；0.5%的盐酸酒精分色，用蒸馏水冲洗15 min；70%和80%酒精先后浸泡10 min，复染伊红1 min，90%酒精分化10 s；95%酒精脱水2次，各10 min，100%酒精脱水2次，各15 min，二甲苯透明3次，每次时间分别为10 min、15 min、15 min；中性树脂封片观察。

1.2.4ELISA检测炎症因子 大鼠心脏取血1 ml，低温离心机4 000 r/min 8 min，取上清液供实验使用。加样：分别设空白孔，标准品待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50 μl，待测样品孔先加样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl。温育：用封板膜封板后置于37℃温育30 min。配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍后备用。洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。加酶：每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外。温育：再次用封板膜封板后置37℃温育30 min。洗涤：再次小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。显色：每孔先加入显色剂A 50 μl，再加入显色剂B 50 μl轻轻振荡混匀，37℃避光显色10 min。终止：每孔加入50 μl终止液，终止反应(此时蓝色立转为黄色)。测定：以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔吸光值(OD值)。测定在加终止液后15 min内进行。

1.2.5TUNEL检测细胞凋亡 大鼠处死后组织经过石蜡包埋，二甲苯中脱蜡5～10 min，换用新鲜二甲苯，再脱蜡5～10 min。无水乙醇5 min。90%乙醇2 min。70%乙醇2 min，蒸馏水2 min。滴加20 μg/ml 不含DNase的蛋白酶K用P0106免疫染色洗涤液(20～37)℃作用15～30 min。PBS洗涤3次。配制适当量TUNEL检测液滴加样品上，37℃避光孵育60 min。洗涤后用抗荧光猝灭封片液封片后显微镜下(激发波长范围为450～500 nm)观察。

1.2.6Masson染色 切片染色前先用蒸馏水润湿玻片30～60 s。加入适量苏木素核染液染色60 s，弃去，清洗液冲洗30 s。加入适量酸性品红浆染液染色30～60 s，弃去，清洗液冲洗30 s。加入适量磷钼酸分色液分色6～8 min，弃去。加入适量苯胺蓝复染液染色5 min，弃去，用无水乙醇冲洗干净。吹干后封片镜检。

1.2.7Western blot检测蛋白表达 收集四组肺组织并取相同部位，PBS清洗3次，用添加蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解提取总蛋白。用BCA试剂盒检测总蛋白浓度，10% SDS-PAGE分离蛋白后用半干转膜仪转移蛋白质至PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，随后加入一抗于4℃封闭过夜，第2天加入对应二抗室温封闭1 h，最后滴加ECL曝光显影。显色并统计灰度值计算相对表达量。

2 结果

2.1QT改善COPD大鼠体重和肺功能指标 QT对大鼠COPD模型治疗后，与Healthy Ctrl组相比，QT组大鼠体重和肺功能间无差异；与Healthy Ctrl组比较，COPD组体重和肺功能均显著下调；与 COPD组比较，COPD+QT组大鼠体重和肺功能均明显改善(图1)。

2.2QT抑制COPD肺脏病理损伤 HE染色实验显示，与Healthy Ctrl组相比，QT组大鼠支气管管腔、上皮及肺泡结构完整，管壁未见变厚，黏膜下层未见炎症性细胞浸润。提示QT使用对大鼠体征没有明显影响；与Healthy Ctrl组比较，COPD组大鼠支气管管腔严重变形，上皮细胞明显脱落，肺泡腔扩大融合成肺大泡，管壁破坏、增厚，管壁周围可见大量炎性细胞浸润；与COPD组比较，COPD+QT组大鼠支气管管腔形变恢复，上皮细胞脱落改善，管壁厚度逐渐恢复变薄，炎症浸润细胞明显减少，肺泡腔扩大融合现象明显改善(图2)。

2.3QT抑制肺泡细胞凋亡及相关因子表达 TUNEL染色实验显示，与Healthy Ctrl组比较，QT组肺泡组织中细胞凋亡数目没有明显差异；与Healthy Ctrl组比较，COPD组细胞凋亡数目显著上升；与COPD组比较，COPD+QT组细胞凋亡水平明显下调(图3A)。Western blot实验结果显示，与Healthy Ctrl组比较，QT组肺泡组织中促凋亡因子Caspase-3和Caspase-9水平差异均无显著统计学意义；与Healthy Ctrl组比较，COPD组Caspase-3和Caspase-9水平均显著上升；与COPD组比较，COPD+QT组Caspase-3和Caspase-9水平则显著下降(图3B)。

2.4QT降低血清中炎症因子表达 ELISA检测血清中相关炎症因子IL-6、TNF-α和IL-10结果显示：与Healthy Ctrl组比较，QT组肺泡组织中相关炎症因子表达水平无差异；与Healthy Ctrl组比较，COPD组炎症因子IL-6和TNF-α表达水平显著上升，而抑炎因子IL-10显著下调；与COPD组比较，COPD+QT组炎症因子IL-6和TNF-α表达水平显著下调，抑炎因子IL-10明显上调(图4)。

2.5QT降低肺泡组织肺纤维化及凋亡通路分子活性 Masoon染色实验显示，与Healthy Ctrl组相比，QT组极少蓝色着色于肺泡细胞，大量胞浆被染成红色；与Healthy Ctrl组比较：COPD组大量具有较深蓝色着色于细胞中，很少胞浆红色减少；与COPD组比较：COPD+QT组肺泡细胞着蓝色降低，胞浆着红色逐渐加深(图5A)。Western blot检测肺泡组织中TGF-β1和α-SMA结果显示：与Healthy Ctrl组比较，QT组TGF-β1和α-SMA表达水平无差异；与Healthy Ctrl组比较，COPD组TGF-β1和α-SMA表达水平显著上升；与COPD组比较，COPD+QT组TGF-β1和α-SMA表达水平受到显著下调(图5B)。

图1 不同处理组大鼠基本指标测量Fig.1 Basic indexes of rats in different treatment groups were measuredNote: Healthy ctrl.Healthy rats;QT group.Rats received QT;COPD group.Rats treated by the LPS and cigarettes;COPD+QT.Rats treated by the LPS,cigarettes and QT.QT were treated for 4 weeks.**.P<0.01 compared with the control group;##.P<0.01 compared with COPD group.Bars,SEs.

图2 HE染色鉴定肺泡细胞形态(×200)Fig.2 HE staining detected alveolus pulmonis cells morphology(×200)Note: QT were treated for 4 weeks.

图3 肺泡组织中凋亡相关因子表达水平Fig.3 Expression of apoptosis-related markers were detected in alveolus pulmonis Note: A.TUNEL；B.Western blot.**.P<0.01 compared with the control group;##.P<0.01 compared with COPD group.Bars,SEs.

图4 ELISA检测显示血清中相关炎症因子表达水平Fig.4 Expression of inflammatory factors were detected in serum by Note: **.P<0.01 compared with the control group;##.P<0.01 compared with COPD group.Bars,SEs.

3 讨论

COPD是一种进展性疾病，最终会演变为每天发作，如行走或增加压力都会导致呼吸困难[13]，严重影响患者生活质量。COPD患者肺内含有多种炎症细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肺泡巨噬细胞等，炎性细胞被刺激因子激活后能够产生炎症介质，进而损害气道壁和肺部组织[14,15]。COPD属于严重的公共卫生问题，目前已被行业列入重大疾病慢病管理体系内。有关病理演变机制的研究已经证明：慢性气道炎症是关键，病情进展与肺对有害颗粒或气体的异常炎症反应有关[9,10]。

QT几乎存在于所有植物中，作为人类正常饮食的一部分，已具有悠久历史。随着对QT生物和药理活性研究逐渐深入，越来越多的研究证明QT对人体颇有裨益，包括抗癌、抗过敏、抗炎、抗动脉粥样硬化和保心功能[16,17]。本研究也证实，对大鼠连续四周给药(50 mg/kg)后，对大鼠体重、肺功能、肺泡结构和凋亡等进行检测发现，与正常大鼠比较并未有明显差异。说明重要制剂QT对生物体具有较小影响，对大鼠没有明显毒性作用。此外一些前瞻性研究表明QT可有效抑制冠状动脉、肺动脉血管收缩和降低血压的功效[18]。更有研究表明QT可以显著逆转肺动脉高压的形成[19]。本研究结果显示，QT可以显著改善COPD大鼠肺损伤情况，降低肺泡细胞凋亡和炎症因子水平，抑制凋亡发生和炎症水平。

图5 肺纤维化及各处理相关凋亡基因表达水平Fig.5 Fibrosis and apoptosis related makers were detected in alveolus pulmonis Note: A.Masson；B.Western blot.**.P<0.01 compared with the control group;##.P<0.01 compared with COPD group.Bars,SEs.

TGF-β1可以抑制多种细胞增殖并诱导上皮细胞凋亡，同时又可以诱导间质样细胞增殖和向肌成纤维细胞分化，来促进伤口愈合和组织纤维化形成[20]。有研究表明，TGF-β1被认为是体内促纤维化生长因子最重要的分子。如IPF和博来霉素诱导的肺纤维化损伤中显示TGF-β1表达增加[21]。TGF-β1体外可以激活成纤维细胞，体内过表达可以造成肺持续的纤维化进程[22]。TGF-β1调节肌成纤维细胞的主要方式是通过控制α-SMA来促进细胞外基质蛋白(胶原蛋白和黏联蛋白)分泌；也有许多纤维化信号激活肌成纤维细胞功能的信号也由TGF-β1调节或激活[23]。TGF-β1一方面降低TNF-α活性来降低炎症因子IL-6来抑制免疫炎症[24-26]，IL-6是由多种细胞产生、具有诱导B细胞活化产生抗体的多功能细胞因子，可以通过凝聚胶原蛋白，抑制细胞外基质分解，刺激成纤维细胞增殖，导致COPD气道纤维结缔组织形成及平滑肌增生，从而参与COPD气道重构[9,10]。而IL-10作为多效抗炎性细胞因子，具有重要的抗炎及免疫抑制作用[27]。本研究证明，COPD大鼠模型中TGF-β1和α-SMA的表达量急剧上升；但在经过QT治疗后，TGF-β1和α-SMA的表达量明显下调，接近正常组大鼠体内的表达水平，同时大鼠肺纤维化的程度也明显缓解。

常见的凋亡途径分为：内源性凋亡(线粒体途径)和外源性途径。内源性途径常与细胞压力应激相关，当细胞感受到压力之后便会激活BH3，使抗凋亡因子Bcl-2降低，从而减少对凋亡促进因子Bax抑制，最终通过Caspase-9诱导Caspase3/6/7激活造成细胞发生凋亡；而外源性途径则是依赖FASL，TNF-α及TRAIL与细胞上死亡受体结合后，进一步激活Caspase 8来诱导Caspase3/6/7激活造成细胞凋亡[28]。本研究发现COPD疾病模型组大鼠经过QT治疗后，Caspase-3和Caspase-9都受到明显下调。TGF-β信号分子在多种重要信号途径中参与多细胞应答，如细胞增殖、分裂、凋亡、免疫及炎症应答等[29-31]。TGF-β1可以结合TNF-α共同抑制Caspase-3依赖的凋亡通路来抑制凋亡发生。综合研究结果可以证明，当COPD模型大鼠经过QT治疗后可以显著地降低TNF-α和TGF-β1的表达水平，有效降低下游Caspase-3和Caspase-9的活性，从而降低肺泡细胞凋亡发生。

综上所述，QT对COPD有一定保护作用，通过降低TGF-β1、TNF-α和α-SMA活性来抑制细胞凋亡及降低细胞炎症因子释放。本研究通过COPD损伤大鼠模型初步探究QT在临床治疗COPD损伤方面具有相关性和可行性。但是QT在体内发挥功能的信号通路比较复杂，需要进一步明确其相关信号转导机制并选择关键靶点分子才能为精准治疗慢性阻塞性肺疾病提供指导。