杜文静 罗 莉 孟 岩 吉 鹏 董旭南

(新疆医科大学第一附属医院风湿免疫科，乌鲁木齐830000)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种T细胞和B细胞参与的以滑膜炎为主的全身性免疫性疾病，其具体致病机制还不清楚[1,2]。RA不仅会导致患者关节出现病变，还会对关节周围的组织造成损伤。寻找RA发生发展的相关指标具有重要的临床意义[3]，已有证据表明调节性B细胞(Regulatory B cells,Bregs)和IL-17、IL-10等炎症因子在RA中发挥重要的作用[4]。

Breg细胞是一类具有特殊功能的B细胞亚群，它们参与免疫应答和抑制免疫反应。Bregs能够通过产生调节性的细胞因子(如IL-10和TGF-β) 或者直接与病原性的T细胞相互作用抑制免疫反应的B细胞，其已成为免疫调节中研究热点之一。Breg细胞具有较大的异质性。其中有一类CD1dhighCD5+CD19high的Breg细胞，主要分布于脾脏、肠系膜淋巴结及成年鼠的腹腔内，能产生IL-10，被命名为B10细胞[5]。 同时，还有研究表明Breg不仅在RA中发挥重要作用，还在诸如系统性红斑狼疮和原发性干燥综合征等自身免疫性疾病中发挥了重要作用[6,7]。

细胞因子在疾病发生与发展过程中起重要作用，其中IL-10及转化生长因子(Transforming growth factor,TGF-β)为主要的致炎细胞因子，可作用于多种免疫细胞，通过一系列的级联反应，最终导致关节炎症和骨破坏。IL-10为主要的抗炎细胞因子，可减轻关节肿胀，抑制炎症细胞浸润，促进炎症细胞因子的产生，改善软骨退化[8,9]。体外实验中，通过IL-10刺激B细胞活化，并将活化后的B 细胞过继转移至糖尿病小鼠模型内，可抑制免疫反应并减缓病程的发展[10]。在体内实验中，发现IL-10缺陷小鼠在感染寄生虫后Breg细胞仍能够抑制炎症反应，证明Bregs不仅仅通过IL-10来发挥免疫调控作用[11]，后来证实Breg的调控作用还和TNF-β等其他细胞因子有关。

本研究旨在研究Bregs细胞在RA疾病中的可能作用机制，探讨IL-10和TGF-β在CIA小鼠模型中的变化及其同Bregs细胞比例的内在联系，这可为RA疾病的预防和治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料 Ⅱ型胶原购自美国Sigma公司；Trizol、Primescript RT-PCR试剂盒购自美国ThermoFisher公司；SYBR green Tag qPCR mix购自美国Roche公司；流式细胞小球微阵列试剂盒、流式细胞术所用FITC-CD1d抗体、PE-CD5抗体和APC-CD19抗体购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1Ⅱ型胶原诱导类风湿关节炎小鼠动物模型的建立 20 只Wistar雄性小鼠，随机分为2组，对照组和CIA组各10 只。CIA组将充分乳化的0.2 mlⅡ型胶原乳剂(200 μg)注射到小鼠的足跖部皮下，初次免疫一侧注入Ⅱ型胶原乳剂；7天后用同样方法2次免疫，另一侧一次性注入Ⅱ型胶原乳剂0.2 ml。对照组小鼠右后足趾皮内注射生理盐水。同时，用游标卡尺记录小鼠左后足踝关节的上下径。每天观察并记录小鼠的生命体征、饮食、活动及关节变化情况，并对关节炎指数进行评分和统计。具体的小鼠动物评分标准为：0分表示没有肿胀；1分表示指关节肿胀或出现红点；2分表示腕或踝关节轻微肿胀；3分表示整个脚爪重度肿胀；4分表示畸形或关节僵硬。最后，将每个脚爪的分数相加，每只小鼠最高评分为16分。每组的发病率为脚爪发生病变的小鼠只数除以该组小鼠总数的百分比。

1.2.2苏木精-伊红(HE)染色观察细胞变化 用10%福尔马林固定小鼠滑膜组织，并用不同浓度的酒精脱水，用二甲苯进行透明处理后进行石蜡包埋。将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片(5～8 μm)。放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。依次用二甲苯脱蜡、酒精进行至水和苏木精和伊红染色操作。

1.2.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测IL-10和TGF-β mRNA的表达水平 根据说明书，用TRIzol方法从冷冻组织中提取总RNA，并使用PrimeScript RT-PCR试剂盒(Thermo)制备cDNA。β-肌动蛋白作为内对照。用Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR仪，采用SYBR预混 Taq (Roche) 酶对cDNA进行定量分析。所有组别均进行3次重复，并使用2-ΔΔCT方法计算mRNA的相对表达量。

1.2.4流式细胞小球微阵列(Cytokine bead array, CBA)技术检测IL-10和TGF-β含量 将待测血清与试剂盒中带有IL-10和TGF-β抗体的微珠(beads)进行混合，并按说明书操作稀释标准品。充分混匀后室温避光孵育2 h，加入1 ml清洗液洗1次，最后加入300 μl缓冲液，上机检测。

1.2.5流式细胞术检测Breg细胞比例变化 取对照组和CIA组小鼠脾脏，经过研磨破碎分离脾脏细胞。调整细胞密度为1×107个/ml，取50 μl细胞悬液分别加入0.2 μl抗体，室温孵育2 h, 后用流式细胞仪检测Breg细胞水平。

2 结果

2.1CIA组与对照组关节炎指数评分比较 对照组足爪关节无红肿；模型组小鼠足跖部出现肿胀，关节明显红肿增粗，活动受限(图1)。模型组与对照组关节炎评分比较差异具有统计学意义(表 1)。

2.2CIA组与对照组关节滑膜HE染色比较 对照组小鼠滑膜层由 1～2 层滑膜细胞组成，细胞排列整齐，无增生，无炎症细胞浸润；CIA造模组，滑膜层排列不整齐，有 3～5 层明显增生，水肿，有大量的炎症细胞浸润，出现新生血管(图2)。同时，CIA组滑膜组织中IL-10和TGF-β的表达量均高于正常组(图3)。

2.3CIA组与对照组IL-10和TGF-β的mRNA表达的结果 与对照组小鼠滑膜组织中IL-10 mRNA及TGF-β mRNA的表达水平相比较，CIA造模组小鼠滑膜组织中IL-10 mRNA及TGF-β mRNA的表达水平分别为2.95±0.65，2.89±0.63；CIA组小鼠滑膜内IL-10及TGF-β mRNA高表达，且两组中IL-10、TGF-β的mRNA表达差异具有统计学意义(图4)。

图1 小鼠关节炎情况Fig.1 Evaluation of arthritis severity in CIA model

表1 对照组与CIA组比较

Tab.1 Disease score in control group and CIA grou

GroupsWeight(g)ThicknessErythemaand SwellingLimitationof motionScoreControl group15.6±2.10000CIA group15.9±2.33.6±0.61)3.7±0.51)1.8±0.91)12.3±1.81)

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

图2 小鼠关节滑膜HE染色(×400)Fig.2 HE staining of mice synovial tissue of joint (×400)

2.4CBA法测定CIA组与对照组血清中IL-10、TGF-β的含量比较 对照组相比，CIA组中IL-10、TGF-β血清中含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05),见表2。

2.5CIA组与对照组流式细胞术结果比较 以CD1dhighCD5+CD19high定义小鼠Breg细胞。在正常小鼠脾脏中，对照组Breg细胞占的总比例为(12.98±0.93)%，CIA造模小鼠脾脏中Breg细胞占的总比例为(20.88±2.17)% (图5)，两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。说明CIA组小鼠脾脏中Breg细胞细胞数增多。

图3 对照组和CIA组小鼠滑膜中IL-10与TGF-β的表达情况 (×200)Fig.3 IL-10 and TGF-β expression in synovial tissue of control and CIA mice(×200)

图4 滑膜组织中IL-10和TGF-β mRNA的相对表达Fig.4 Relative mRNA levels of IL-10 and TGF-β in synovial tissuesNote: *.P<0.05.

表2 对照组与CIA组IL-10,TGF-β表达

Tab.2 IL-10 and TGF-β expression levels

GroupsIL-10(pg/ml)TGF-β(pg/ml)Control group58.45±7.3423.59±6.35CIA group90.01±9.011) 64.95±11.311)

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

图5 对照组与CIA造模组流式结果图Fig.5 Flow cytometry results of control and CIA group

3 讨论

RA是一种以关节滑膜炎为特征的、伴随骨和软骨结构进行性破坏、最终导致关节破坏和畸形的慢性炎症疾病，在人群中发病率为0.5%～1% 。迄今发现RA的发病机制与遗传、环境和患者状态等因素相关，但其详细机制尚不完全清楚。RA的重要特征是机体免疫功能紊乱，其具体涉及T、B淋巴细胞，巨噬细胞和自然杀伤细胞等多种免疫细胞的变化，并且已证实Breg在胶原诱导类风湿关节炎小鼠模型(Collagen-induced arthritis,CIA)以及类风湿性关节炎患者中发挥了免疫抑制作用[12]。Breg发挥免疫抑制作用最重要的机制之一就是通过分泌IL-10来调节免疫反应。作为机体重要的抗炎因子，IL-10的靶细胞是抗原提呈细胞(APC，antigen presenting cell)和T淋巴细胞。IL-10可抑制TNF-β等炎症因子的释放，减少APC细胞中共刺激与黏附相关分子的表达；其次，IL-10还可以影响CD4+T细胞的分化发挥免疫调节的作用[13]。此外，一些调节性细胞因子(IL-21、TGF-β和转录因子Foxp3等)和一些小分子蛋白酶类物质也共同参与RA的发生和发展。最后，在临床检测中B细胞占外周血中比例相对较少，B细胞亚群中的Breg细胞就更少了，给具体的临床检测和机制研究带来了一些困难。

为解决上述问题，本研究中首先建立了CIA小鼠模型，以研究RA的发生发展，并为将来的药物筛选和治疗奠定基础。发现CIA组小鼠足跖部出现肿胀，关节明显红肿增粗。CIA组与对照组关节炎评分差异显著(P<0.05)。为探究Breg细胞在RA中的机制，以CD1dhighCD5+CD19high标记Breg细胞，通过与对照组相比，发现CIA组小鼠脾脏中Breg细胞比例明显增多(P<0.05)，证明小鼠脾脏中Breg细胞发生增殖和活化，并直接参与了RA过程。同时，CIA组滑膜细胞水肿，排列不整齐，有 3～5 层明显增生，有大量的炎症细胞浸润，并且CIA组滑膜细胞中IL-10和TGF-β的mRNA表达水平差异显著(P<0.05)。此外，CIA组血清中IL-10和TGF-β的含量较对照组显著升高(P<0.05)。上述结果RA中伴随着表明小鼠血清和滑膜组织中IL-10和TGF-β表达水平同脾脏中Breg细胞比例成正相关，推测Breg细胞可引起小鼠血清话滑膜组织中的IL-10和TGF-β的升高。Breg细胞表达IL-1R和IL-6R，可以被炎症反应中的促炎细胞因子IL-1β和IL-6激活并在炎症部位富集[14]。在关节炎小鼠模型中，髓源性细胞如巨噬细胞产生的IL-1β和IL-6可以促进Breg细胞的分化以及在关节滑膜的富集。然而，炎症部位Breg细胞并不发挥促进炎症反应的作用，Breg细胞在关节滑膜处的富集也不是引发关节炎的因素。相反，在关节滑膜富集的Breg细胞可以进一步响应炎症部位的炎症因子如IL-21,GM-CSF等的刺激[15，16]，通过产生IL-10、TGF-β等炎症抑制因子，负向调控炎症反应，并抑制关节炎疾病的进展。因此，Breg细胞在关节滑膜处富集并分泌炎症抑制因子是机体自身免疫平衡调控的结果。

综上所述，IL-10、TGF-β作为RA疾病过程中重要的细胞因子，在类风湿关节炎发病过程中上调表达，可一定程度上作为评价疾病活动度及判断疗效的重要指标。而炎症部位的IL-10和TGF-β可能来自于Breg细胞。Breg细胞相应促炎因子的刺激在关节滑膜处富集，并通过分泌IL-10和TGF-β等抑制性细胞因子介导免疫耐受，抑制过度免疫反应。本研究揭示了Breg细胞在类风湿关节炎发病进程中的重要作用，能够为类风湿关节炎治疗提供新思路，也相信通过动物模型的深入研究将会为RA的临床诊断和治疗提供更多依据。