贾玉香，耿晓琦，黄正梅，杜鹏，郑宇，宋佳*

1(天津科技大学 生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心，天津， 300457)2(德州昂立达生物技术有限公司，山东 德州，253000)

根瘤菌胞外多糖(extracellcer polysaccharides ofRhizobium，REPS)[1-3]是根瘤菌属在生长过程中分泌的胞外多糖，是由一定数目的重复单位聚合而成的不均一微生物多糖。微生物多糖具有广泛的免疫调节功能，如具有促进S180荷瘤小鼠的白细胞和淋巴细胞增生的作用[4]、抗氧化作用[5-7]和免疫活性[8-11]等。但是跟大多数微生物多糖一样，产量低依然是根瘤菌多糖应用受限的因素之一。近年来，国内外学者对微生物多糖的发酵优化做了大量研究[12-16]，单因素实验和正交实验是优化发酵工艺的基础方法，适用于碳氮源和发酵条件的优化，而对于多因素多水平的大批量实验，通常采用数理统计优化法[17]，如Plackett-Burman设计法、全因子实验法、响应面优化设计法、随机平衡法、正交设计法、均匀设计法等和非数理统计优化法，而众多实验表明Plackett-Burman设计法是最为准确和有效的，实用性强[18-19]。Plackett-Burman法[20]是一种以不完全平衡块为原理的部分析因实验设计法，适用于从众多的考察因素中筛选出最为重要的几个因素，并且快速有效。本研究中，采用Plackett-Burman设计，在众多因素中筛选影响产量的关键因素，进而采用Box-Behnken实验[21]得到最优添加量组合，得到根瘤菌多糖的最适发酵条件，并探究其抗肿瘤活性，为根瘤菌多糖的开发与利用提供理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 实验菌种

RhizobiumNG10 (中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC 10579)，保藏于天津科技大学微生物制药研究室。

1.2 培养基

斜面培养基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 5，琼脂20。种子培养基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 5，pH 6.8～7.0。发酵培养基(g/L)：甘露醇 10，K2HPO40.25， MgSO4·7H2O 0.2，酵母提取物 1，NaCl 0.1，pH 6.8～7.0。DMEM培养基：DMEM复合培养基粉末，青霉素100 U/mL，链霉素 100 U/mL，胎牛血清10 %，PBS缓冲液配制，pH 7.4。

1.3 仪器与设备

TGL-16 G台式高速离心机，上海医用分析仪器厂；754 PC紫外-可见光分光光度计，上海菁花科技有限公司；Alpha 2-4 LD plus快速冷冻干燥机，德国chirst公司；HH.CP-T型01A CO2细胞培养箱，上海一恒科技有限公司；SYNEK GY4多功能酶标仪，美国BioTek。

1.4 主要试剂

酵母提取物，英国DXOID公司；胰蛋白胨，英国DXOID公司；酵母膏、酵母浸粉、大豆蛋白胨、蛋白胨(均为分析纯)，北京奥博星生物技术有限责任公司；H3PO4、乙醇、NaCl、KH2PO4、苯酚、浓H2SO4(均为分析纯)：天津化学试剂二厂；葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、果糖、蔗糖、MgSO4·7H2O(均为分析纯)，天津市耀华化工厂；三氯甲烷(分析纯)，天津市大茂化学试剂厂；正丁醇(分析纯)，天津津东天正精细化学试剂厂；人肝癌细胞株Hep G2，中国科学院上海细胞库；噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(均为分析纯)，北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清，美国GIBCO公司。

1.5 实验方法

1.5.1 葡萄糖标准曲线的绘制

精密称取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品10 mg，去离子水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得质量浓度为0.1 g/L得葡萄糖标准溶液。精密量取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL,分别置于具塞试管中加水至1.0 mL，各加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，置冰水浴中加浓H2SO45 mL，摇匀，置30 ℃水浴中保温30 min，取出后冷却至室温，于490 nm测吸光度，绘制标准曲线。

1.5.2 多糖的提取及含量测定

将发酵培养至稳定期的根瘤菌发酵液离心除去菌体，浓缩至一定体积后加入4倍体积无水乙醇于4℃过夜醇沉，取沉淀部分加水复溶，用Sevage法除蛋白，Sevage试剂与多糖溶液的体积比为1∶4，反复除蛋白数次后，分离Sevage试剂，再经乙醇洗涤后，加水复溶，用去离子水透析48 h，然后将多糖溶液在200～400 nm进行全波长扫描，经鉴定260和280 nm处无吸收峰后表明蛋白已除净，收集多糖溶液，采用苯酚-硫酸法测定发酵液中多糖含量。

1.6 发酵培养基的优化

1.6.1 单因素实验

分别以麦芽糖、乳糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇为碳源，质量浓度为10 g/L，其他成分与基础发酵培养基相同，于100 mL/250 mL摇瓶中接种对数期根瘤菌菌液1 %，置于28 ℃ 180 r/min培养箱中振荡培养72 h，按苯酚硫酸法测定多糖含量，每种碳源做3组平行。

在碳源优化的基础上，分别以大豆蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉、胰蛋白胨、硫酸铵、酵母提取物为氮源，质量浓度为1 g/L，其余条件相同，发酵结束后测定多糖含量，每种氮源做3组平行。

1.6.2 Plackett-Burman设计实验

根据碳氮源的单因素实验结果，采用SAS Version 8.0.2 软件设计8因素2水平实验方案，采用该方案进行实验，并采用SAS Version 8.0.2 对结果进行分析处理，以筛选培养基各成分中对多糖产量影响最为显著的若干因子。

1.6.3 Box-Behnken设计实验

在PB实验结果基础上，采用SAS Version 8.0.2 软件设计Box-Behnken实验方案，获得最优组合，根据该方案进行实验，针对结果进行分析以获得最优培养基配方。

1.7 体外抗肿瘤[22]实验

将人肝癌细胞Hep G2于DMEM培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养至对数生长期。用胰蛋白酶消化处于对数生长期的肝癌细胞Hep G2，稀释细胞浓度至1.0×105个/mL，分别移取150 μL细胞悬液于96孔板中，贴壁培养4 h，加入50 μL不同浓度的多糖溶液(质量浓度分别为20，50，100，200，500和1 000 μg/mL)，分别在培养24和48 h后，加入20 μL MTT试剂(5 g/L)，混匀，于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养4 h，移除孔板中液体，每孔加入200 μL DMSO振荡培养10 min，溶解结晶，于570 nm测吸光值。空白对照组为DMEM培养基，每组实验组均有8个复孔。多糖对肝癌细胞Hep G2的抑制率计算公式(1)如下：

(1)

式中：A0为空白组在570 nm处的吸光值，A1为实验组在570 nm处的吸光值。

2 结果与分析

2.1 多糖提取及含量测定

以标准葡萄糖浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，建立的线性回归方程为:y=0.077 3+5.67x(R2=0.995 6)。初始发酵培养基条件下，发酵至稳定期(48 h)时，根瘤菌胞外多糖产量为3.46 g/L。

2.2 发酵培养基优化

2.2.1 单因素实验

对于碳氮源筛选的单因素实验结果如图1和图2所示，不同碳源对多糖产量均有显著性影响(P<0.05)，碳源为麦芽糖时，胞外多糖产量最高为3.62 g/L；大豆蛋白胨、酵母浸粉和酵母膏对多糖产量影响显著(P<0.05)，以大豆蛋白胨作氮源时，胞外多糖产量为4.23 g/L。显然，麦芽糖和大豆蛋白胨为最优碳氮源。

图1 不同碳源条件下根瘤菌产胞外多糖含量Fig.1 Content of extracellular polysaccharides producedby Rhizobium NG10 with different carbon sources注：与初始发酵培养基相比，*代表P<0.05。下同。

图2 不同氮源条件下根瘤菌产胞外多糖含量Fig.2 Content of extracellular polysaccharides producedby Rhizobium NG10 with different nitrogen sources

2.2.2 Plackett-Burman设计实验结果

采用PB实验(麦芽糖、大豆蛋白胨、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl和CaCl27个因素分别以X1～X7表示，及一个X8虚拟项)，筛选出对根瘤菌发酵所得期望值(Y值)影响显著的因素。其中，各个因素的水平设置及结果如表1所示，对所有实验结果进行一元线性回归分析得多元一次方程：Y=3.89+0.17×X1-0.38×X2+0.23×X3-0.03×X4+0.11×X5+0.14×X6-0.047×X7+0.095×X8。

评价模型的拟合度需要参考决定系数(R2)，R2值越接近1，模型就越能用来预测响应值。该模型的相关系数R2= 0.973 5(表2)，说明97.35 %的期望值变化可以用这一模型解释，模型拟合度较好。采用常规的F检验方法对模型再次进行分析，可知其线性模型的P值为0.026 9<0.05，说明模型显著可靠，能很好地描述实验因素与响应值间的关系。软件分析得到的回归分析结果如表2所示。可见，各考察因素的重要性依次为X2>X3>X1>X6>X5>X8>X7>X4。其中最显著的3个因素为大豆蛋白胨(X2)，K2HPO4(X3) 和麦芽糖(X1)。

表1 Plackett-Burman实验方案及结果Table 1 The design matrix and the results of Plackett-Burman design

表2 Plackett-Burman设计实验回归分析结果Table 2 Regression analysis results of Plackett-Burman design experiment

2.2.3 Box-Behnken设计实验结果

以PB实验设定值为中心点，采用SAS Version 8.0.2软件设计Box-Behnken实验，实验方案如表3所示，进一步优化麦芽糖、大豆蛋白胨、KH2PO4添加量的水平，获得最佳培养基配方。根据该方案进行实验，针对结果进行分析以获得最优培养基配方。采用SAS Version 8.0.2对实验方案及结果进行回归分析，得到多元二次回归方程：Y=4.98+0.13×U1-0.09×U2+0.08×U3-0.25×U1×U1+0.11×U1×U2-0.002×U1×U3-0.71×U2×U2-0.007×U2×U3-0.06×U3×U3。

采用t检验对模型的各项系数进行显著性分析，结果如表4所示。模型决定系数R2为0.980 1，说明98.01 %的期望值变化可以用这一多项式解释。此外，该分析模型P<0.001证明了二次回归模型高度显著。模型的失拟项的F值和P值分别为7.23和0.123 8，证明失拟项不显著。一次项(U1、U2)，二次项(U1U1、U2U2)对响应值的影响高度显著，P<0.05。软件得出最大响应值及其对应U1、U2、U3的编码值，可得根瘤菌(RhizobiumNG10, CICC 10579)最佳培养基配方(g/L)为：麦芽糖22.5，大豆蛋白胨9.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO40.41，NaCl 0.1，在此条件下，胞外多糖产量为5.05 g/L，比原始提高了45.95 %。

表3 Box-Behnken实验方案及结果Table 3 The design matrix and the results of Box-Behnken design

2.3 体外抗肿瘤实验

通过体外细胞实验，考察不同给药剂量分别在24与48 h对Hep G2细胞增值抑制的效果，结果如图3所示。

图3 不同浓度根瘤菌多糖对肝癌细胞Hep G2的抑制作用Fig.3 Antitumor activity(Hep G2) of Rhizobiumpolysaccharide with different concentrations注：与对照组相比，**代表P<0.01；***代表P<0.001。

由图3可知，REPS显示出良好的抗肿瘤活性，在给药浓度≥50 μg/mL时，与空白对照组相比，多糖对肝癌细胞有显著的抑制作用。在一定范围内，REPS对肝癌细胞Hep G2的抑制作用随着多糖浓度的升高而增大，随着剂量、给药时间的增加，细胞增殖能力逐渐降低；在多糖质量浓度达到1 000 μg/mL时，抑制率达到56.74 %。采用MTT法计算IC50值，结果显示给药24 h，REPS对Hep G2的IC50值为624.2 μg/mL，给药48 h，REPS对Hep G2的IC50值为393.3 μg/mL，发现REPS具有良好的抗肿瘤活性。

表4 Box-Behnken设计实验回归分析结果Table 4 Regression analysis results of Box-Behnken design

3 结论

根据单因素实验、Plackett-Burman实验和Box-Behnken实验，得到优化的培养基配方为麦芽糖22.5 g/L，大豆蛋白胨9.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO40.41 g/L，NaCl 0.1g/L，在此条件下，最高胞外多糖产量5.05 g/L；在此基础上进行根瘤菌胞外多糖的抗肿瘤活性评价，从体外实验可以看出，根瘤菌胞外多糖REPS对肝癌细胞Hep G2有良好的抑制作用，并且一定范围内存在量效关系。

本文虽然较大程度上提高了根瘤菌NG 10(CICC 10579)的胞外多糖产量，但影响其产量的因素还有很多，对其产糖能力还有待进一步挖掘。近20年来，人们对植物与真菌活性多糖进行了大量研究，并取得较大进展，然而对于细菌活性多糖的研究却较少。根瘤菌胞外多糖的研究前景十分广阔，包括其信号功能，免疫调节功能以及抗肿瘤功能，可以说根瘤菌多糖的价值很高。希望未来对根瘤菌胞外多糖的研究能更进一步，发挥出它在生产及生活中的价值。