王晓丽 秦杰 王敏 王利祥 杜维俊

（山西农业大学农学院，太谷 030801）

根瘤菌可以与豆科植物形成不同类型的根瘤，如和大豆、百脉根形成有限型根瘤；和苜蓿、豌豆形成无限型根瘤两种类型，从而能够共生固氮，其固氮量占生物固氮量的60%［1］。大豆作为重要的共生固氮经济作物，其生长所需氮素营养的50%-90%是由根瘤菌-大豆共生体系固定的，因此对大豆根瘤菌的研究具有巨大的实际应用价值［2］。前人研究表明根瘤菌具有明显的生物地理分布特征。Zhang等［3］利用种水平的rpoB高通量测序方法，在对我国东北、黄淮海和南方3个大豆种植区土壤中的土著大豆根瘤菌的研究中，发现黄淮海的土著大豆根瘤菌多样性最高，包括，Bradyrhizobium sp.III、B. japonicum、B. elkanii、B. huanghuaihaiense、Sinorhizobium fredii和S. sojae。而位于黄淮海的山西作为大豆的起源地之一，大豆种质资源丰富。根瘤菌与大豆在进化过程中是相互影响，共同进化的，因此与其共生的根瘤菌资源也相当丰富。但是，针对山西大豆根瘤菌的大量分离却报道很少。

目前，对于根瘤菌的分类采用表型和基因型相结合的多相分类办法。根瘤菌的表型分析，包括在不同碳源和氮源培养基上的生长情况、在YMA上生长的单菌落形态、耐盐性、对不同生长温度、pH的耐受性，BTB产酸或产碱判定等。表型的测定，不仅工作量大，易受环境影响，重复性还差，但仍是根瘤菌分类鉴定及发表新种的必需条件［4］。根瘤菌的基因型分析，包括DNA（G+C）mol%的测定及DNA-DNA杂交、16S/23S rRNA同源性分析、共生基因（NodA、NodC、NifH）同源性分析、限制性片段长度的多型性、随机扩增DNA片段的多型性、REPBOX/BOX-PCR/ERIC-PCR指纹图谱分析、持家基因MLSA（多位点序列分析）等［5-7］。相较于表型的鉴定，随着测序技术的高速发展，基因型的测定快速、准确，已成为分类的主要依据。16S rRNA进化树确定其系统发育地位构成多相分类的主干，通常被用来确定属、种的分类。然而，16S rRNA基因较高的保守性，使其在种以下水平的分类应用中受到限制［8］。指纹图谱中，尤其是BOX-PCR，操作简便，不需要菌株的特异性 DNA 探针，对基因组的要求不高，容易获得较为丰富的扩增条带，这说明BOX-PCR指纹图谱分析更适合于种及种以下水平上遗传多样性研究［9］。

根瘤菌的利用在减少氮肥的使用、增加产量和农业可持续发展等方面有巨大的潜能。但国内的根瘤菌使用情况与巴西、美国、阿根廷等几个大豆主产国还相距甚远［10］。由于土壤中土著根瘤菌的存在，使得菌剂的竞争性较差，接种效果差强人意［11］。通过对土著根瘤菌的分离，筛选出既适应当地土壤条件，竞争效果好，又与地方大豆品种共生固氮效果好的根瘤菌，可以有效避免这一问题。因此，本研究通过分离、鉴定山西的土著根瘤菌，并将其分类，以期通过苗期筛选出与山西主栽大豆品种的匹配性好的土著根瘤菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和大豆品种：菌株分离自山西大同广灵（黄壤沙土）、太原清徐（盐碱土）、晋中太谷（黄壤土）。大豆品种为晋大88号黄豆，科丰1号黑豆。

1.1.2 培养基与试剂 YMA培养基：甘露醇10 g，酵母粉3 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.25 g，KH2PO40.25 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 000 mL，pH值6.8-7.0。

刚果红培养基：1 000 mL YMA培养基中加入0.5%的刚果红溶液5 mL。

BTB培养基：YMA液体培养基中加入溴百里香酚蓝（BTB）使其终浓度为0.01%，调节溶液pH，使溶液呈淡黄绿色。

EasyTaq＠ DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 根瘤菌的分离与纯化 选取不同大豆品种根上个大、饱满的根瘤，当天进行分离培养。分离、纯化方法参照Peter等［6］方法，具体如下：在超净工作台中，依次放置6个灭菌的培养皿，依次倒入无菌水、75%乙醇、5%的NaClO溶液，后3个倒入无菌水。将取下的根瘤依次放入培养皿中，每个浸泡的时间为5 min，然后用镊子将根瘤夹破，将创伤面贴在含有刚果红的YMA培养基上。在28℃下倒置培养3-4 d。挑取未被染色的乳白色、粘稠状的菌落在刚果红YMA培养基上多次划线，获得单菌落。之后在培养基上划线扩繁，制备成25%的甘油菌并保存-80℃冰箱。

1.2.2 根瘤菌的表型与基因鉴定 将分离的菌株进行关键结瘤固氮基因nifH、nodA PCR扩增，对能扩增出目标条带的菌株，再进行16S rDNA扩增，以及BTB染色鉴别。引物如表1所示。菌液PCR反应体系为 ：EasyTaq DNA Polymerase 0.3 μL，10×EasyTaq＠ Buffer 1.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.3 μL，F 引物 0.3 μL，R引物0.3 μL，菌液培养3 d左右（OD600=0.5），DNA模板（煮沸的菌液）1 μL，最后ddH2O补足到15 μL。nifH PCR 反应程序为 ：94℃预变性 4 min，94℃ 变性 30 s，56℃ 复性 30 s，72℃延伸 1 min，30个 循 环 ；72℃ 延 伸 10 min。nodA和 16S rDNA PCR反应程序分别是57℃复性30 s，72℃延伸36 s，55℃复性30 s，72℃延伸1.5 min，其余与nifH PCR反应程序一样。将PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送去北京六合华大进行测序。测序结果在NCBI数据库Blast后，选择相似性较高的序列，在MEGA7.0软件利用邻接法构建系统发育树来确定根瘤菌的分类地位。

表1 根瘤菌基因鉴定所用引物Table 1 Primers for gene identification of rhizobia

1.2.3 BOX-PCR 用 BOX A1R（5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′）扩增根瘤菌DNA的重复区域。PCR 反应体系与1.2.2一样。反应程序为：94℃预变性 4 min，94℃ 变性 1 min，53℃ 复性 1 min，72℃延伸5 min，30个循环；72℃延伸10 min。80 V电压下，BOX-PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳2.5 h，将照胶图片保存为TIFF格式。所有跑胶图片在Bionumerics＠7.5软件采用UPGMA算法和Cosine系数进行聚类分析，以70%的相似性进行根瘤菌的分类。

1.2.4 根瘤菌与大豆的匹配性筛选 将蛭石灭菌，装入10 cm×10 cm的双层营养钵中。晋大88号黄豆和科丰1号黑豆用70%的无水乙醇进行表面消毒5 min，再用5%的NaClO消毒5 min，之后用无菌水清洗3次，播种到营养钵中并在温室中培养。一周后间苗，每个营养钵留一株长势一致的大豆。用无氮营养液浇灌，待第一片真叶展开时，每株大豆接3 mL菌液（OD600=0.5），以不接菌作对照，接种USDA110做参照菌株，3次重复。4周后进行指标测定。测定指标包括株高、地上部分鲜重、根鲜重、植株干重、根瘤数、根瘤鲜重。

1.2.5 数 据 分 析 采 用 Excel、DPS（V9.01）、MEGA7.0、Bionumerics＠7.5对数据进行分析。

2 结果

2.1 根瘤菌的分离、纯化

对菌落形态进行观察后，发现菌株的单菌落一般为圆形或椭圆形，表面湿润，不透明，乳白色，微微凸起，这些生长表型均同根瘤菌的基本特征相符（图1-A）。快生型根瘤菌一般生长3 d，菌落直径就可达到2 mm，慢生型根瘤菌生长5-7 d，菌落直径为1 mm。共分离出203株菌，并用分离地将其命名，分离自山西大同广灵、太原清徐和晋中太谷分别命名为GL、QX和TG（附表1）。

图1 根瘤菌表型鉴定Fig.1 Phenotype identification of rhizobia

2.2 根瘤菌的表型与分子鉴定

nifH固氮基因扩增条带为460 bp，nodA结瘤基因扩增条带为660 bp，16S rDNA扩增条带为1 400 bp（图2）。203株菌中有187株可以扩增出nifH和nodA基因，基本确定为根瘤菌。对这187株根瘤菌进行BTB染色鉴别，其中172株快生型根瘤菌，产酸变黄（图1-B）；15株慢生型根瘤菌，产碱变蓝（图1-C）。将前25株快生型根瘤菌的nifH、nodA、16S rDNA的PCR产物测序，3个基因都属于中华根瘤菌属（Sinorhizobium），且与S. fredii有99%以上的相似性，但是并不能很好将菌株区分。因此，不再依次对后续菌株进行测序。挑选BOX-PCR三类带型不同的慢生型根瘤菌，进行16S rDNA测序鉴定种属，均属于慢生型根瘤菌（Bradyrhizobium），以能与大豆结瘤的慢生型根瘤菌Bradyrhizobium japonicum，B. diazoefficiens，B. liaoningense，B. elkanii，B.yuanmingense，B. canariense，B. huanghuaihaiense，B. daqingense做参比菌株构建进化树，表明QX13和B. diazoefficiens同源性较高，GL67、GL76和B.daqingense同源性较高（图3-6）。

图2 根瘤菌基因鉴定结果Fig. 2 Gene identification results of rhizobia

图3 nifH 进化树Fig. 3 nifH phylogenetic tree

图4 nodA 进化树Fig. 4 nodA phylogenetic tree

图5 16S rDNA 进化树Fig. 5 16S rDNA phylogenetic tree

图6 慢生型根瘤菌16S rDNA 进化树Fig. 6 16S rDNA phylogenetic tree of Bradyrhizobium

2.3 根瘤菌BOX-PCR结果

将全部根瘤菌进行BOX-PCR，其电泳条带的大小在5 000 bp-400 bp之间，条带数目在25-3条不等（图7）。将187株根瘤菌进行BOX-PCR，去除条带完全一致的菌株，用剩余的85株菌和两个参比菌株USDA110、S. fredii 45436进行聚类分析。这87株根瘤菌以45%的相似性可分为A、B、C、D和E五大类群，其中B类群为慢生型根瘤菌，A、C、D和E类群为快生型根瘤菌，根瘤菌QX13表型和16S rDNA鉴定为慢生型，却聚类到快生型根瘤菌中的A群中，GL19表型鉴定为快生型，却聚类到慢生型根瘤菌中的B群中（图8）。以70%的相似性可将这87株菌共分为18类，两个参比菌株各为一类，本实验分离的根瘤菌分为16类，表明分离的土著根瘤菌与两个参比菌株相似性差距较大。16个聚类中11个由少于3个分离株组成，3个由4个分离株组成，1个由5个分离株组成，剩下的第一、三、六类聚到的根瘤菌株较多。第一类的9株菌株全部分离自广灵；第三类32株菌株，除1株分离自广灵外，其余全部分离自太谷；第六类14株菌株，7株分离自太谷，7株分离自广灵，但其在72%的水平上便各自分为一类，第一小类9株中，7株分离自太谷，2株分离自广灵，第二小类5株，全部分离自广灵。表明根瘤菌具有较强的地域性。

图7 BOX-PCR电泳结果Fig. 7 Results of BOX-PCR electrophoresis

图8 BOX-PCR聚类结果Fig.8 Results of BOX-PCR clustering

2.4 根瘤菌与大豆的匹配性筛选

从分离的16类土著根瘤菌中，每一类挑选出一株代表性菌株进行共生匹配性筛选。接种根瘤菌的晋大88号植株长势整体要比CK好，接种效果明显（图9-A），接种根瘤菌的科丰1号植株长势和CK差别不大，接种效果不明显（图9-B）。接种不同根瘤菌的2个大豆品种都在株高、地上干重和根干重存在显著差异（表2）。接种不同根瘤菌的2个大豆品种也都在根瘤鲜重、根瘤干重和根瘤数有显著差异（表3）。表明接种的菌株都可以和这两个大豆品种结瘤，但不同的根瘤菌与大豆品种匹配性存在较大差异。接种同一根瘤菌的晋大88号的根瘤性状要好于科丰1号，除接种GL16和QX13外，其根瘤大小没有太大区别（图10），表明科丰1号较晋大88号对根瘤菌的识别更加严格。通过对根瘤生物量和植株生物量的比较，发现其并非严格对应，根瘤性状最好的，地上性状并非最好，可能与根瘤菌的固氮能力有关。筛选出与晋大88号匹配性较好的根瘤菌GL11和GL43，其地上部分干重较接种USDA100分别增加38.5%、30.1%；根干重分别增加22.2%、27.8%；根瘤鲜重分别增加24.3%、41.5%；根瘤干重分别增加36.6%、31.0%。筛选出与科丰1号大豆匹配性较好的根瘤菌TG37，其株高、地上干重、根干重、根瘤鲜重、根瘤干重和根瘤数较接种USDA110分别增加8.1%、15.0%、28.6%、27.3%、44.3%和60.6%。

图9 根瘤菌与大豆的匹配性实验的大豆植株长势Fig.9 Soybean plant growth in the matching experiment between rhizobia and soybean

表2 根瘤菌与大豆匹配性筛选中植株性状的比较Table 2 Comparison of plant traits between rhizobium and soybean in matching screening

表3 根瘤菌与大豆匹配性筛选中根瘤性状的比较Table 3 Comparison of nodule traits between rhizobium and soybean in matching screening

图10 根瘤菌与大豆的匹配性实验的根瘤图片Fig. 10 Picture of nodules in the matching experiment between rhizobia and soybean

3 讨论

本研究从山西大同广灵、晋中太谷、太原清徐共分离203株菌，其中187株根瘤菌可以扩增出nifH和nodA基因。通过BTB染色鉴定172株为快生型根瘤菌，包括了大同广灵的84株，晋中太谷的88株；15株为慢生型根瘤菌，包括了大同广灵的12株，太原清徐的3株。挑选前25株快生型根瘤菌进行nifH、nodA和16S rDNA测序，与相似菌株建立进化树，表明其都属于S. fredii。挑选3株慢生型根瘤菌进行16S rDNA测序，构建的进化树显示从大同广灵的分离的两株GL67、GL76属于 B. daqingense，在山西广灵是首次分离出来。B.daqingense最先从黑龙江省大庆市分离鉴定出来［15］。在酸性和中性土壤中一般以慢生根瘤菌为主，在碱性土壤中一般以费氏中华根瘤菌（S. fredii）为主［16］。QX13属于B. diazoefficiens，是从清徐的盐碱土中分离。葛诚等［17］从辽宁铁岭地区的盐碱土中分离出超慢型大豆根瘤菌。在新疆盐碱地中，S. fredii（45%）和B. liaoningense（43%）是大豆根瘤菌的优势类群，B. japonicum、B. yuanmingense和Rhizobium为次要类群［18］。同为盐碱土，因地理位置和气候条件的不同，大豆根瘤菌种类也有较大差异。

不同的生态区，大豆主栽品种和农家品种各不相同。张璐等［19］通过宏基因组高通量测序分析了大豆根区、根际到根瘤的细菌群落构成，发现大豆对细菌群落的构成有明显的逐层过滤和富集作用，其中在大豆非根际土壤中的优势根瘤菌是Bradyrhizobium属和 Mesorhizobium属，在根际土壤中主要的优势根瘤菌是Sinorhizobium属和 Rhizobium属，根瘤内部的优势菌是Sinorhizobium属。大豆对根瘤菌的特异性识别，使得大豆根瘤菌的分布差异更加明显。史清亮等［20］从山西分离根瘤菌情况表明S.fredii为优势菌，占分离菌总数的90%，而且菌株类型也较多，分布最广，抗逆性较强，是山西省大豆侵染结瘤的主要类群和优势资源菌株，与此次的分离结果相同。张红侠等［21］还从山西分离出两类慢生型根瘤菌为B. liaoningense和B. japonicum。

利用BOX-PCR以45%的相似性将87株根瘤菌分为A、B、C、D和E五大类群，其中B类群为慢生型根瘤菌，A、C、D和E类群为快生型根瘤菌，根瘤菌QX13表型和16S rDNA鉴定为慢生型，却聚类到快生型根瘤菌中的A群中，GL19表型鉴定为快生型，却聚类到慢生型根瘤菌中的B群中，QX13和GL19在59%的相似性上都独自聚为一类，可能是不同的PCR仪、不同批次电泳、电泳液对结果的影响［22］。在BOX-PCR分析中，相似度低于70%的菌株被认为是差异较大的，并被单独分为一类［23］。以70%的相似性可将这87株菌分为18类，两个参比菌株各为一类，本实验分离的根瘤菌分为16类，分离的土著菌株在基因组上差别较大，而且，从同一地区分离的菌株一般聚到一类，与王卫卫等［24］对东北三省的根瘤菌分类情况相似，说明根瘤菌具有较强的地域性分布。综合表明山西的根瘤菌资源丰富、种类多样。

根瘤菌与大豆复杂识别调控机制，造就了两者极强的种属特异性，环境也对共生固氮的效果产生较大影响，筛选出适应性广，竞争力强的根瘤菌一直是科研工作者努力的目标。张红侠等［25］通过蛭石初筛和土壤复筛获得的优良耐旱菌株 B.liaoningense4345和 S. fredii4338，接种晋豆25可显著提高植株生物量、全氮量和产量，具有较强竞争能力，具有良好的应用前景。蒋攀等［26］综合水培实验、盆栽和大田小区试验筛选出了与四川大豆主栽品种贡选号、南豆号匹配性最佳的菌株S65。本研究结果显示两个大豆品种都可以和16种根瘤菌结瘤，晋大88的结瘤效果整体比科丰1号的好，不管是接种分离的土著根瘤菌，还是USDA110。表明科丰1号对根瘤形成调控更加严格。结瘤固氮是高耗能的过程，豆科植物通过结瘤自调控（AON）来调控碳氮平衡，通过地上部分生物量的比较，也可以部分解释科丰1号的结瘤效果更差。通过匹配性筛选，表明不同的根瘤菌与大豆品种匹配性存在较大差异，这与伍慧等用8株优良大豆根瘤菌与不同地区27个大豆主栽品种的匹配性研究结果相似［27］。与晋大88号匹配性较好的是GL11和GL43，其地上部分、根和根瘤的生物量都较接种USDA110增加在22.2%-41.5%。与科丰1号匹配性较好的是TG37，其地上干重、根干重、根瘤鲜重、根瘤干重和根瘤数较接种USDA110增加在15.0%-60.6%之间。为后续研究提供候选菌株。

4 结论

本研究从山西分离出187株根瘤菌，172株为快生型根瘤菌，属S. fredii，是当地的优势菌，15株为慢生型根瘤菌，分别属B. diazoefficiens和 B.daqingense。BOX-PCR聚类表明，此次分离的根瘤菌分为16类，表明山西根瘤菌资源丰富，种类繁多。通过苗期的匹配性筛选，能够与晋大88号共生固氮效果好的是GL11和GL43，与科丰1号共生固氮效果好的是TG37。为后续的大田实验提供菌剂资源。

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