李梦云，张 华，刘亚丽，张 慧，庄雪晴

（1.安徽建筑大学 环境与能源工程学院，安徽 合肥 230601；2.环境污染控制与废弃物资源化利用安徽省重点实验室，安徽 合肥 230601）

胞外聚合物普遍存在于活性污泥絮体内部和表面，附着于微生物的表面，对微生物生命活动具有一定的保护功能，可以抵御对微生物细胞有毒害作用的杀菌剂和有毒物质[1]。同时，胞外聚合物具有富集环境中营养物质的功能，在胞外各种酶的催化下，将营养物质降解为微生物可吸收利用的小分子物质[1]。而在污水生物处理过程中，胞外聚合物会受到污水中各种环境因素的干扰，如抗生素、重金属及农药等，破坏胞外聚合物结构和功能，从而威胁微生物的生命安全，影响到污水处理的效果[2]。因此，研究环境因素对胞外聚合物的影响具有重要意义。

胞外聚合物中蛋白质和多糖为主要成分，两者占胞外聚合物总量的70%～80%。四环素类抗生素是目前医疗和养殖业用量最大的抗生素之一，通过人类及动物排泄物等途径进入城市污水管网，在全球多地区的污水处理厂中均有此类抗生素检出[3]。在污水处理过程中，四环素通过氢键和范德华力与胞外聚合物中的蛋白质结合，从而改变蛋白质的结构，使胞外聚合物丧失功能，影响污水处理效果[4]。铜离子在畜禽养殖中被大量使用，促进动物生长同时增强动物的抗病能力，进入动物体内的铜离子部分随排泄物排出进入污水处理设施。胞外聚合物表面含有大量带负电荷的基团，在污水处理过程中，铜离子可以与带负电的基团发生络合沉淀和离子交换，从而改变或破坏胞外聚合物内部结构，对污水处理产生不利影响[5]。然而，污水中的污染物往往不是单独存在，研究表明混合物会形成更复杂的作用[6]。污水生物除磷是污水生物处理极其重要的部分，而污水中四环素和铜离子往往以混合的形式存在。因此，研究四环素和铜离子对污水生物除磷微生物胞外聚合物的影响具有重要意义。然而，四环素和铜离子形成的混合污染物对生物除磷过程中微生物胞外聚合物联合作用的研究却极其缺乏。

该实验选用四环素和铜离子作为典型污染物，研究四环素、铜离子及其混合污染物对生物除磷微生物胞外聚合物的影响。首先测定单独四环素和铜离子作用下，胞外聚合物中蛋白质和多糖含量的变化；再利用直接均分射线法[7]设计3 种不同浓度配比的四环素和铜离子的混合污染物，测定不同浓度配比下混合污染物对微生物胞外蛋白质和多糖的含量，并结合三维荧光研究蛋白质的变化，为科学评价四环素和铜离子对微生物胞外聚合物的作用风险提供依据和数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验装置及运行

该实验选用序批试活性污泥反应器，通过厌氧-好氧交替运行的方式实现生物除磷。实验用水为人工配制的模拟污水厂进水，配药成分如表1所示。通过微电脑时控装置自动控制反应器运行，运行周期为360 min，其中包括进水20 min、厌氧75 min、好氧180 min、沉淀60 min、出水5 min 和闲置20 min。

表1 实验用水配方

1.2 投加污染物及样品采集测定方法

各反应器投加四环素浓度依次为0 mg/L、0.01 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L；铜离子浓度依次为0 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L；反应器编号分别为1*、2*、3*、4*、5*、6*、7*、8*。该实验每隔12 h 取样取至96 h，包括各阶段水样和污泥混合样。胞外聚合物中的蛋白质和多糖分别采用BCA 法测定和蒽酮法测定；MLSS 采用重量法测定；正磷酸盐采用钼锑抗分光光度法测定。

1.3 污染物抑制效应分析

每周期的比吸磷率即该周期厌氧阶段末期与好氧阶段末期的正磷酸盐含量之差与MLSS的比值。利用比吸磷率的抑制率表示生物除磷微生物受抑制程度，污染物作用时比吸磷率的抑制率M，其计算如公式（1）所示：

C——污染物浓度，mg/L；

C0——污染物半数效应浓度即EC50，mg/L。

利用Logistics 函数拟合四环素和铜离子的浓度和比吸磷率抑制率值获得浓度-效应曲线，得到四环素和铜离子的半数效应浓度分别为7.455 mg/L和8.464 mg/L。

1.4 不同配比的混合物实验设计

利用直接均分射线法（EquRay）设计3 种不同配比的四环素和铜离子混合物，分别为L1、L2 和L3，其配比值分别为0.297、0.894 和2.676。根据稀释因子法[9]在每个浓度配比下设计9 组（含空白对照组）四环素和铜离子混合物，混合物浓度依次为0 mg/L、0.339 mg/L、0.692 mg/L、1.412 mg/L、2.882 mg/L、5.882 mg/L、12.005 mg/L、24.500 mg/L、50.000 mg/L，对应9 个反应器，反应器编号分别为1*、2*、3*、4*、5*、6*、7*、8*、9*。

2 结果与讨论

2.1 四环素对生物除磷中微生物胞外聚合物中蛋白质和多糖的影响

在生物除磷反应器中投加不同浓度四环素后微生物胞外聚合物中蛋白质和多糖的变化情况如图1 所示。由图1 可知，投加四环素后，在0～36 h各反应器的蛋白质和多糖均出现增加趋势，并在36 h 达到最大值，此时各反应器的蛋白质浓度最大达到78.39 mg/gVSS；多糖浓度最大达到15.48 mg/gVSS。而在36～96 h 时，蛋白质和多糖含量均出现逐渐减少的趋势。当四环素作用时间为96 h 时，各反应器的蛋白质浓度最低降至13.83 mg/gVSS；多糖浓度最低降至4.62 mg/gVSS。

图1 不同浓度四环素作用下胞外聚合物组成成分变化

根据微生物胞外聚合物中蛋白质和多糖含量变化可知，蛋白质和多糖均出现先增加后减少的趋势。前期含量增加可能是由于投加四环素初期，活性污泥中的微生物受外来污染物刺激，分泌更多聚合物在微生物表面形成更严固的网状结构保护层，用于抵抗不利的外界环境[10]。随后含量减少可能是由于随着四环素的持续输入，胞外聚合物中更多的蛋白质与四环素以氢键和范德华力结合，胞外聚合物蛋白质中更多结合位点被四环素占据，导致胞外聚合物肽链结构被严重破坏[11]；同时四环素能够特异性地结合到微生物体内核糖体30S 亚基中A 的位置，有效阻止了胺基酰-tRNA 与核糖体上此位置的联结，进而抑制肽链的进一步增长，最终导致蛋白质的合成受阻，进而使微生物丧失功能，蛋白质和多糖含量均下降[12]。

2.2 铜离子对生物除磷中微生物胞外聚合物中蛋白质和多糖的影响

生物除磷反应器中投加不同浓度铜离子后微生物胞外聚合物中蛋白质和多糖的变化情况如图2 所示。由图2 可知，投加铜离子后，在0～12 h 各反应器的蛋白质出现小幅度的下降；在12～48 h 各反应器的蛋白质出现增加趋势，并在48 h 达到最大值，此时各反应器的蛋白质浓度最大达到75.93 mg/gVSS。在0～48 h各反应器的多糖出现增加趋势，并在48 h 达到最大值，此时各反应器多糖浓度最大达到14.12 mg/gVSS。而在48～96 h 时，蛋白质和多糖含量均出现逐渐减少的趋势。当铜离子作用时间为96 h 时，各反应器的蛋白质浓度最低降至15.22 mg/gVSS；多糖浓度最低降至4.98 mg/gVSS。

图2 不同浓度铜离子作用下胞外聚合物组成成分变化

根据微生物胞外聚合物中蛋白质和多糖含量变化可知，初期蛋白质含量小幅度减低，可能是反应器进水中铜离子迅速与蛋白质结合，导致蛋白质结构改变失活形成聚沉[13]。随后蛋白质和多糖均出现先增加后减少的趋势。前期增加可能是因为铜离子的加入产生了不利的环境条件，刺激微生物分泌更多的胞外聚合物，保护微生物细胞减少污染物对微生物的不利影响[10]。随后蛋白质和多糖含量减少，可能是由于铜离子的持续投加，胞外聚合物表面的大量带负电的基团与铜离子发生离子交换、络合沉淀，改变或破坏胞外聚合物内部结构[14]；同时，蛋白质是铜离子的强配体，蛋白质的氨基酸侧链与铜离子通过静电作用相结合，破坏蛋白质结构使蛋白质失活，进而使微生物丧失功能，蛋白质和多糖含量下降[15]。

2.3 三种浓度配比混合物对微生物胞外聚合物蛋白质和多糖的影响

2.3.1 不同浓度配比下微生物胞外聚合物蛋白质和多糖含量变化

三种浓度配比四环素和铜离子的混合物对生物除磷中微生物胞外聚合物中蛋白质和多糖的影响如图3 所示。由图3 可知，三种配比下蛋白质和多糖均出现先增大后减小的现象。混合物投加初期对微生物产生刺激作用，微生物为了保护细胞不受污染物的毒害作用分泌更多的胞外聚合物，形成保护屏障，从而蛋白质和多糖均出现不同程度的增加。随反应时间增加，微生物胞外聚合物遭到破坏，蛋白质和多糖呈现不同程度的下降趋势。因此，投加三种配比混合物，微生物胞外聚合物中蛋白质和多糖均出现了先增加后逐渐减小的现象。

图3 三种浓度配比混合物对生物除磷中微生物胞外聚合物组成成分的影响

三种配比下混合物投加初期，蛋白质和多糖浓度逐渐增加。其中，配比为L1 时最大分别为74.60 mg/gVSS 和12.77 mg/gVSS；配比为L2 时最大浓度分别68.81 mg/gVSS 和12.53 mg/gVSS；配比为L3时最大浓度分别70.02 mg/gVSS 和13.49 mg/gVSS。由此可见，当混合物配比为L1 时，蛋白质和多糖增加量最大，可能是由于铜离子占比高，四环素与铜离子发生络合作用后，铜离子占主导作用，胞外聚合物表面大量带负电荷的基团与铜离子结合，且蛋白质是铜离子的强配体，为了保护细胞不受污染物的毒害作用，从而初期刺激微生物分泌更多的胞外聚合物[10]。当混合物配比为L2 时，四环素和铜离子所占比例比较接近，四环素分子中含有酚羟基和二甲基酰胺等基团与铜离子结合发生络合反应[15]，导致投加混合污染物初期刺激微生物分泌的胞外聚合物量较配比L1 和L3 少。当混合物配比为L2 时，四环素占比高，四环素与铜离子发生络合作用后，四环素占主导作用，研究发现胞外聚合物中主要成分蛋白质与四环素发生反应，而胞外聚合物表面含有多种官能团与金属离子有更强的结合能力，因此，反应初期刺激微生物分泌胞外聚合物相对L1 少[16]。

2.3.2 三种浓度配比下微生物胞外聚合物的三维荧光光谱

三种配比混合物作用下，3*、5*、7*和9*反应器微生物胞外聚合物的三维荧光光谱如图4所示。由图4 可知，三维荧光光谱主要有两个区域。其中区域Ⅰ为酪氨酸峰（Ex 为200～250 nm，Em 为300～380 nm），区域Ⅱ为类色氨酸峰（Ex 为250～300 nm，Em 为300～380 nm），这两种均为芳香类蛋白质荧光峰。三种配比混合物作用下，随混合物浓度的增加，酪氨酸峰和类色氨酸峰荧光强度均逐渐减弱。其中，配比L2 中酪氨酸峰和类色氨酸峰荧光强度比配比L1 和配比L3 的峰度减弱程度更明显。三种配比混合物作用下，随混合物浓度增加，微生物胞外聚合物中酪氨酸和类色氨酸荧光强度逐渐减弱，说明四环素和铜离子混合物对酪氨酸和类色氨酸的荧光产生了猝灭作用，且随着混合物浓度的增加猝灭现象越显著。研究表明，四环素或铜离子均可与酪氨酸、类色氨酸发生络合作用，所生成的络合物不再发出荧光，因此酪氨酸峰和类色氨酸峰荧光强度逐渐减弱[16-17]。

图4 三种浓度配比混合物作用下生物除磷中微生物胞外聚合物的三维荧光光谱图

3 结论

不同浓度四环素和铜离子分别单独作用下，微生物胞外聚合物中蛋白质和多糖含量均出现先增加后减少的趋势。三种配比的混合物作用下微生物胞外聚合物中蛋白质和多糖含量也出现了先增加后减少的趋势。其中，四环素和铜离子配比为0.297 时，铜离子占比较大，混合物投加初期胞外聚合物中蛋白质和多糖增加量三种配比下相对最高；四环素和铜离子配比为0.894 时，四环素与铜离子浓度相当，混合物投加初期胞外聚合物中蛋白质和多糖增加量三种配比下相对最低。三种配比混合物作用下，随混合物浓度增加，微生物胞外聚合物中蛋白质三维荧光强度逐渐减弱。