郭苏兰 李佳娜 肖水秀

(深圳市龙华区中心医院，广东 深圳 518110)

缺血性脑血管病(ICVD)是一种比较常见的高致残性和高致死性的心脑血管疾病，严重危害人类健康。脑组织缺血可导致神经细胞发生不可逆的死亡，如发生肿胀、 裂解、细胞器游离等病理改变，进一步引起细胞的自噬、凋亡和坏死〔1〕。而脑缺血再灌注损伤(CIRI)是指缺血脑组织恢复血流后，神经细胞损伤和功能不但没有恢复，反而进一步加重的现象〔2〕。临床上常常通过溶栓治疗方法防治缺血性脑病，其发病机制目前尚未完成阐明，可能与炎症反应、细胞自噬、细胞凋亡、兴奋性氨基酸毒性作用、等氧化应激等有关〔3〕。目前临床上对CIRI的防治尚无特效药物或手段，因此，寻找新的药物来防治脑缺血再灌注损伤是非常必要的。贝母素甲(PM)为贝母的主要活性成分之一，属于生物碱类物质〔4〕。研究表明〔4〕PM具有明显的抗炎作用。目前，关于PM对CIRI的作用及其机制未见相关研究报道。本研究旨在探讨PM是否通过影响CIRI的炎症反应和自噬机制而起保护作用。

1 材料与方法

1.1动物 实验动物为健康C57BL小鼠144只，SPF级，雌雄各半，体重18～22 g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK(粤)2015-0004。

1.2药物与试剂 PM：阿拉丁试剂有限公司；阿司匹林片(ASA，规格 0.3 g/片，丹东医创药业有限责任公司)；肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒、白细胞介素(IL)1β ELISA检测试剂盒和IL-10 ELISA检测试剂盒(博士德生物技术有限公司)；总蛋白定量测试盒(南京建成股份有限公司)；尼龙栓线(广州佳灵生物技术有限公司)；氯化三苯四氮唑(TTC，Sigma-Aldrich)。小鼠源单克隆LC3-Ⅱ抗体(Nanotools 0231-100/LC3-5F10)，兔单克隆β-arresting抗体(ab32099)(Abcam)，兔单克隆Beclin-1抗体(Cell Signaling Technology)，内参照为小鼠源单克隆β-actin抗体(碧云天AA128)。

1.3造模及分组 动物按体重随机分为假手术组、模型组、ASA组、PM 低、中、高剂量组(PM-L组、PM-M组、PM-H组)各24只。各组于造模前连续灌胃给药3 d，ASA组小鼠灌胃给药2 mg/(kg·d)，PM低、中、高剂量组小鼠分别灌胃给药1 mg/(kg·d)，2 mg/(kg·d)，4 mg/(kg·d)，假手术组和模型组小鼠灌胃给予等量生理盐水。各组小鼠末次给药3 h后，参照文献〔5〕方法造模。主要方法如下：2%异戊巴比妥钠麻醉小鼠，将小鼠仰卧固定于37℃手术台，小心将颈部毛发剃去，并使用75%酒精消毒剃毛皮肤，颈部正中纵向切开长约1.5 cm的皮肤，暴露和分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，然后将颈外动脉远端结扎，颈外动脉远心端剪一小口，并将尼龙拴线于剪口处插入，轻轻伸入颈内动脉，微遇阻力后立即停止推进，固定栓线。缺血30 min后，小心拔出尼龙拴线，再灌注24 h，建立小鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。造模成功标准：小鼠清醒后出现同侧Horner征和对侧上肢重于下肢的瘫痪症状。

1.4神经功能学评分 按照Longa等〔6〕5分制法对各组小鼠进行行为学评分。评分方法如下：无精神损伤症状计为0分；未能完全伸展对侧前爪计为1分;向对侧转圈计为2分；向对侧倾倒计为3分；不能自发行走，意识丧失计为4分。其中0分视为造模不成功，造模后死亡或昏迷2 h以上小鼠均视为造模失败，不计入动物结果。

1.5脑梗死体积测定 小鼠2%异戊巴比妥钠麻醉后，并颈椎脱臼处死，开颅小心取脑，使用30 ml生理盐水分别冲洗3次，将脑组织放于-20℃冰冻30 min，将脑置于脑膜具，分别于额极向枕极行冠状切片，厚度均为2 mm，共5片，0.5% TTC染液37℃避光孵育30 min，扫描仪扫描，使用Image-Pro Plus图像分析处理软件计算和统计脑梗死率，其中脑梗死率=梗死面积/总面积×100%。

1.6脑组织形态学观察 4%多聚甲醛固定脑组织，自来水流水浸泡24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，片厚5 μm，常规苏木素-伊红(HE)染色，观察脑组织海马齿状回形态学变化。

1.7脑水含量测定 小鼠开颅取脑后，生理盐水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，准确称量并计为湿重，然后把脑组织置于105℃恒温干燥箱干烤72 h，并准确称取脑组织计为干重，脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.8脑组织炎症因子的测定 使用玻璃匀浆器，按照1∶9的质量体积比〔脑组织(g)∶生理盐水(ml)〕制备10%脑组织匀浆液，并离心(4℃，3 000 r/min，5 min)取上清液，按照试剂盒操作步骤测定肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-10。

1.9自噬蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和β-arrestin的表达检测(Western印迹) 小心分离出缺血侧半球脑皮质，加入适量放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液，使用玻璃匀浆器于冰上匀浆，离心(10 000 r /min，4℃，40 min)，取上清即为检测样品。二喹啉甲酸(BCA)法定量检测蛋白浓度，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离目的蛋白，湿法转膜，5% 脱脂牛奶封闭4 h，分别加入一抗β-arrestin (1∶800)，LC3-Ⅱ(1∶200)，Beclin-1(1∶800)和内参β-actin(1∶4 000)，4℃过夜，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶5 000)，化学发光检测(ECL)试剂盒显色检测蛋白条带。以β-actin 灰度值作为内参照，采用 quantity one Image J 软件进行图像灰度值分析。

1.10统计学方法 采用SPSS15.0 软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1行为学评分观察 与假手术组〔(0.00±0.00)分〕比较，模型组小鼠行为学分数〔(3.75±0.34)分〕明显升高(P<0.01)，表现为小鼠向左侧倾倒或旋转，观察左侧前爪不能完全伸展，甚至不能行走。与模型组比较，ASA组和PM-L、PM-M、PM-H组行为学分数均明显降低〔(2.45±0.32)分、(3.12±0.31)分、(2.32±0.25)分、(2.22±0.23)分，P<0.05〕，各给药组小鼠的行为学表现均明显改善。与PM-L组比较，PM-H组小鼠行为学分数明显降低(P<0.05)。

2.2脑梗死体积观察 与假手术组〔(0.00±0.00)%〕比较，模型组小鼠脑梗死率显著升高〔(45.21±4.23)%，P<0.01〕。与模型组比较，ASA组和PM-L、PM-M、PM-H给药组小鼠脑梗死率明显降低〔(25.45±3.24)%、(30.54±3.25)%、(23.48±2.16)%、(12.35±1.98)%，P<0.05〕。与PM-L组比较，PM-H组小鼠脑梗死率明显降低(P<0.05)。见图1。

图1 脑梗死体积观察(TTC染色)

2.3脑组织海马齿状回观察 假手术组海马齿状回神经细胞结构排列正常，细胞层数多，细胞饱满，可见深染的核仁。模型组海马齿状回神经细胞的细胞层明显缩小，排列紊乱，胞质浓缩，核固缩。而ASA组和PM给药组神经细胞凋亡情况明显改善，神经细胞层数较多，排列较整齐。见图2。

2.4脑水含量观察 与假手术组〔(0.10±0.01)%〕比较，模型组小鼠脑组织含水量显著升高〔(1.31±0.12)%，P<0.01〕。与模型组比较，ASA组和PM-L、PM-M、PM-H给药组小鼠脑组织含水量明显降低〔(0.67±0.14)%、(0.18±0.12)%、(0.62±0.15)%、(0.41±0.13)%，P<0.05〕。与PM-L组比较，PM-H组小鼠脑组织含水量明显降低(P<0.05)。

图2 脑组织海马齿状回观察(HE，×20)

2.5脑匀浆TNF-α、IL-1β、IL-10含量观察 模型组小鼠脑匀浆TNF-α和IL-1β含量较假手术组明显升高，而IL-10含量明显降低(P<0.01)。ASA组和PM给药组小鼠脑匀浆TNF-α和IL-1β含量较模型组明显降低，而IL-10含量明显升高(P<0.05，P<0.01)。PM-H组小鼠脑匀浆TNF-α和IL-1β含量明显较PM-L组明显降低，而IL-10含量明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠脑匀浆TNF-α、IL-1β、IL-10含量变化

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05,3)P<0.01；与PM-L组比较:4)P<0.05

2.6缺血半暗带区LC3-Ⅱ表达观察 与假手术组(0.92±0.05)比较，模型组小鼠缺血半暗带区LC3-Ⅱ表达量明显降低(0.25±0.02，P<0.01)。与模型组比较，ASA组和PM-L、PM-M、PM-H给药组小鼠缺血半暗带区LC3-Ⅱ表达量明显升高(0.53±0.03、0.47±0.04、0.72±0.04、0.84±0.06，P<0.01)。与PM-L组比较，PM-H组小鼠缺血半暗带区LC3-Ⅱ表达量明显升高(P<0.01)。见图3。

1～6：假手术组、模型组、AS组、PM-L组、PM-M组、PM-H组图3 缺血半暗带区LC3-Ⅱ表达

3 讨 论

行为学评分和脑梗死率观察是评价模型成功和药物有效性的直接简便的观察方法。本研究结果提示PM可明显改善MCAO行为学和脑组织的坏死。脑缺血性脑功能障碍的主要原因为脑水肿，脑水肿也是脑缺血后最严重的并发症，是导致缺血性脑卒中患者死亡的最主要原因之一〔7〕。本研究提示PM可保护血脑屏障完整性，从而减轻脑水肿。研究发现〔8,9〕炎症参与CIRI发生发展过程，其中TNF-α和IL-1β是炎症的两个重要因子，参与血脑屏障的通透性和促进部分炎性介质表达。发生时， TNF-α 可激活星形胶质细胞和小胶质细胞，分泌大量 IL-1β，引起一系列的炎症级联反应〔10〕，而IL-10 是一种抗炎因子，可减轻炎症反应。本研究发现PM给药组可明显抑制炎症反应，从而减轻CIRI。自噬在机体的生理和病理过程中都能见到，正常机体中主要通过自噬作用清除胞内受损的生物大分子和细胞器，对维持内环境稳定和细胞存活均有重要的意义。已有研究表明CIRI可抑制自噬过程，细胞过度损伤，进一步引起细胞坏死〔11〕。而LC3-Ⅱ作为自噬水平的一个标志物，常用于反映机体自噬水平高低的一个指标。本研究发现PM给药组可明显促进自噬，且呈剂量依赖性。