梁艳 吕康 何标

(安徽师范大学体育学院，安徽 芜湖 241003)

阿尔茨海默病(AD)以异常积聚的老年斑为主要病理特征〔1〕。β淀粉样蛋白(Aβ)主要是由淀粉样蛋白前体蛋白(APP)在β-分泌酶(BACE-1)和γ-分泌酶(PS1)的作用下生成的，因此，APP 、BACE-1和PS1含量对Aβ的生成至关重要〔2〕。Aβ生成增多和清除能力下降是导致脑内Aβ异常聚集的主要原因所在。降解酶降解和跨血脑屏障转运清除是机体清除Aβ的主要形式〔3〕。Aβ降解酶主要有脑啡肽酶(NEP)和胰岛素降解酶(IDE)等〔4〕。低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-1是脑内Aβ进入外周的主要受体，而晚期糖基化终末端产物受体(RAGE)是外周Aβ进入脑内的主要载体〔5〕。脑内Aβ清除障碍或清除速率下降使脑内Aβ异常聚集加快，加速了AD的病理进程〔6〕。截至目前尚无有效治疗AD的药物及方法。已有研究证实，运动能够有效改善AD的学习记忆能力，延缓AD的发生〔7～9〕。但运动延缓AD的作用机制尚不清楚。因此，本实验拟通过12 w中等强度的跑台运动，从Aβ的生成、降解和转运清除3个方面研究运动对转基因(Tg)APP/PS1小鼠海马区Aβ含量的影响。

1 材料和方法

1.1实验动物及分组 选购3月龄雄性Tg APP/PS1小鼠，置于标准动物房，适应性喂养2 w后随机分为运动组(TE组)和安静组(TC组)各12只。

1.2运动干预方案 TE组给予1 w的适应性训练。适应性训练结束后对TE组进行运动干预。运动强度参照文献〔10〕，为最大摄氧量的45%～55%。每次训练持续45 min，运动结束后小鼠为7月龄。

1.3取材 TE组末次运动后禁食12 h，脱颈处死，分离海马。每组取6只用于蛋白质免疫印迹实验，6只用于酶联免疫吸附剂实验。

1.4Aβ40和Aβ42质量浓度的检测 按照文献〔11〕操作步骤进行。严格按照试剂盒说明书进行操作，在450 nm波长下测定光密度D(λ)值，通过标准曲线计算质量浓度。

1.5APP、PS1、NEP、LRP-1和RAGE蛋白相对表达水平的测定 按照文献〔11〕操作步骤进行。取适量海马区，匀浆，离心取上清，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和聚偏氟乙烯(PVDF)转膜。牛奶封闭，加一抗稀释液(LRP-1，ab92544，1∶500；RAGE，ab172473，1∶500；APP，CST2452，1∶1 000；PS1，Santa7860，1∶1 000；NEP，ab16050，1∶1 000)，孵二抗，AIpha成像系统曝光，ImageJ1.46进行灰密度值分析，计算目的蛋白相对表达水平。

1.6统计学分析 采用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

2.1各组海马区APP、PS1蛋白相对表达水平 TE组APP蛋白相对表达水平(1.31±0.13)显著低于TC组(1.78±0.13，P<0.05)。TE组PS1蛋白相对表达水平(1.05±0.30)显著低于TC组(2.10±0.37，P<0.05)。见图1。

2.2各组海马区LRP-1、RAGE、NEP蛋白相对表达水平 TE组LRP-1蛋白相对表达水平(3.32±0.26)显著高于TC组(2.66±0.38，P<0.01)。TE组RAGE蛋白相对表达水平(0.25±0.04)显著低于TC组(0.44±0.05，P<0.01)。TE组NEP蛋白相对表达水平(1.22±0.16)显著高于TC组(0.80±0.08，P<0.05)。见图1。

图1 小鼠海马区NEP等蛋白相对表达水平

2.3各组海马区Aβ40和Aβ42浓度 TE组海马区Aβ42浓度〔(78.49±8.45)ng/ml〕显著低于TC组〔(99.74±10.21)ng/ml，P<0.01〕。TE组海马区Aβ40质量浓度〔(693.45±309.10)ng/ml〕显著低与TC组〔(993.87±68.56)ng/ml,P<0.05〕。

3 讨 论

“Aβ学说”认为细胞外异常聚集的Aβ是AD主要致病因素和中心环节，因此减少脑内Aβ的异常聚集是预防AD的关键所在〔12〕。本实验结果表明12 w中等强度的运动干预能够有效降低海马区Aβ42和Aβ40浓度。研究发现，6 w无刺激的跑台运动显著降低Tg APP/PS1小鼠海马区Aβ40和Aβ42浓度〔13〕。也有研究证实，对Tg2576小鼠进行长期的运动干预后发现，运动组海马区Aβ42浓度较安静组显著下降〔14〕。由此可见，长期中等强度的跑台运动能够有效降低AD小鼠海马区Aβ40和Aβ42浓度，达到运动预防和延缓AD的目的。

Aβ是AD的主要病理标志之一，Aβ主要是由BACE-1和PS1切割APP蛋白生成的〔2〕。因此，降低APP、BACE-1和PS1的含量对减少Aβ生成十分重要。Tg APP/PS1小鼠因海马神经元过表达APP和PS1基因，导致脑内Aβ生成持续增加，6～7月龄小鼠脑内Aβ生成增多〔15〕。本实验证实，长时间中等强度的运动能够通过抑制APP和PS1蛋白相对表达水平，减少Aβ生成。研究证实，5个月的跑台运动显著降低Tg APP/PS1小鼠海马区APP的磷酸化水平和PS1蛋白相对表达水平〔16〕。上述研究结果提示，长期中等强度的运动可能通过抑制APP和PS1蛋白相对表达水平抑制Aβ的生成。

脑内Aβ的清除速率慢于Aβ的生成时，Aβ异常聚集加快，诱发AD〔17〕。脑内Aβ清除能力下降是迟发型AD的主要病因。因此，加速Aβ的清除能够有效延缓AD的病理进程。运动可以提高Aβ降解酶NEP活性加速海马区Aβ的清除〔18〕。而5个月的自主跑轮运动显著提高Tg APP/PS1小鼠海马区NEP的活性〔19〕。由此可见，长期的跑台(或跑轮)运动可以通过增强NEP的活性降低Tg APP小鼠海马Aβ浓度，推测可能是运动增加Tg APP小鼠海马区NEP蛋白相对表达水平和NEP的活性，加速了Aβ降解，但具体的分子机制还需进一步证实。

脑内Aβ的清除主要依靠降解酶和跨血脑屏障两种途径，降解酶系统仅能清除少量的Aβ，而跨血脑屏障(BBB)转运清除途径能够清除脑内大部分的Aβ〔20〕,提高Aβ的外流速率可以有效降低脑内Aβ的含量〔21〕。LRP-1是Aβ由脑内运至外周组织的主要载体，其功能异常降低Aβ的外流速率〔22〕。而RAGE则是Aβ通过BBB进入脑实质的功能载体〔22〕。本研究结果提示，跑台运动能够降低Tg APP/PS1小鼠海马区RAGE蛋白相对表达水平，降低外周血液Aβ的入脑速率。对侧脑室注射Aβ25～35导致AD小鼠进行12 d的自主跑轮运动后发现，运动组海马区RAGE蛋白相对表达水平显著降低〔23〕。也有研究证实，长期中等强度的跑台干预对Tg APP/PS1小鼠海马区RAGE蛋白相对表达水平没有产生影响〔16〕。导致上述研究结果不一致的原因可能是采用的实验动物模型不同导致的。Tg APP/PS1小鼠病理特征主要以海马区Aβ生成增多为主，随着病理进程的不断发展，海马区纤维状Aβ数量和老年斑沉积水平逐渐增多〔24〕。而侧脑室注射Aβ25～35导致的AD小鼠，主要表现为海马区Aβ浓度较野生型小鼠高，海马区纤维状Aβ数量和老年斑沉积水平均少于Tg APP/PS1小鼠。另外，Tg APP/PS1小鼠海马区Aβ浓度的增加是随着小鼠月龄的增长而缓慢增长的，而侧脑室注射Aβ25～35导致的AD小鼠，海马区Aβ浓度在短时间急剧增加，短时间急剧增加的Aβ可能导致机体应激反应，引起机体的生理变化和部分功能蛋白相对表达水平的改变。此外，不同的训练方式可能也是引起上述实验结果不同的原因所在，相对于自主跑轮运动，跑台运动的强度较大，虽然自主跑轮运动强度小于跑台运动，但对实验动物而言，自主运动带来的外界刺激远远小于跑台运动〔25〕。

本实验推测，运动可能通过上调海马区LRP-1蛋白相对表达水平，下调了RAGE蛋白相对表达水平，提高了Aβ跨BBB转运清除速率。研究结果证实〔16〕，对4月龄Tg APP/PS1小鼠进行10 w的跑台运动后发现，运动组海马区LRP-1蛋白相对表达水平显著高于安静组小鼠，提示中等强度的跑台运动通过提高Tg APP/PS1小鼠Aβ外转蛋白相对表达水平，降低Aβ内转蛋白相对表达水平，加速 Aβ跨BBB转运清除速率。

综上，推测长期中等强度的跑台运动通过减少海马区Aβ的生成、提高Aβ的降解和加速Aβ跨血脑屏障转运清除速率3条途径，达到降低海马Aβ质量浓度，延缓AD的病理进程的目的。