饶凤琴， 程玉梅， 张婷， 周青帅， 崔古贞， 齐晓岚**， 洪伟**

(1.贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室&贵州省分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学附院 综合ICU， 贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学 基础医学院， 贵州 贵阳 550025)

艰难梭菌(clostridiumdifficile)是一种革兰阳性、专性厌氧的产芽孢杆菌[1]。研究显示，20%～30%抗生素相关性腹泻及95%～100%伪膜性结肠炎均是由艰难梭菌引起的[2]。艰难梭菌感染(clostridiumdifficileinfection,CDI)主要症状是腹泻，病情加重时会进一步发展为伪膜性结肠炎，甚至导致死亡[3-4]，临床上诊断CDI主要是基于患者的临床症状及实验室检测[5]。粪肠球菌(enterococcusfaecalis)是一种革兰阳性、D-链球菌属、正常存在于人类和其他哺乳动物胃肠道中的兼性厌氧菌[6]。作为一种肠道正常寄生菌，其繁殖速度快，对生长营养条件要求低，因此可通过竞争优势抑制多种肠道病原菌的繁殖[7-8]。从粪便样本中分离获得艰难梭菌纯培养是临床判断CDI最直接的证据，也是研究临床艰难梭菌菌株生理、生化特征和致病机制的重要前提[9]。然而，从临床粪便标本分离艰难梭菌的过程中，因粪肠球菌具有竞争性优势，常常造成艰难梭菌分离失败，并由此可能造成对CDI患者的误诊[10]。因此，建立从粪肠球菌与艰难梭菌共培养物中筛选艰难梭菌的培养方法，是CDI的准确诊断和临床菌株获得的前提[10]。已有研究表明，常用的艰难梭菌分离培养基为脑心浸出液-酵母粉培养基(brain heart infusion yeast, BHIS)[11]、环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂培养基(cycloserine-cefoxitin-fructose agar, CCFA)[12]、胰蛋白胨-酵母粉培养基(tryptone yeast, TY)[13]和胰蛋白胨-酵母粉-葡萄糖培养基(tryptone yeast glucose, TYG)[14]，在粪便样本中有大量粪肠球菌存在时这些培养基常发生艰难梭菌分离失败。因此，本研究拟探讨不同生产厂家BHIS培养基、不同抗生素和是否添加羊血(或血清)组合对临床分离艰难梭菌中粪肠球菌污染的去除效果。

1 材料与方法

1.1 菌株及培养条件

粪肠球菌和艰难梭菌混合物取自医院ICU病房患者粪便[15]。艰难梭菌630质控菌株购自美国典型菌种保藏中心，脑心浸出液(brain heart infusion, BHI)粉末分别购自青岛海博生物科技有限公司、杭州微生物试剂有限公司、北京索莱宝科技有限公司和杭州百思生物技术有限公司，酵母粉购自英国Oxoid公司，胎牛血清购自中国四季青公司，中性红、琼脂粉、脱纤维羊血、厌氧产气袋购自美国Thermo Fisher公司，厌氧培养盒购自日本MGC Anaero Pack公司。艰难梭菌置于厌氧培养盒中，37 ℃恒温静置培养(液体培养8～12 h，固体平板培养18～24 h)。

1.2 方法

1.2.1培养基的配制 BHIS培养基分别按照不同厂家说明书称取BHI(北京索莱宝3.85 g、青岛海博3.85 g、杭州百思3.6 g、杭州微生物5.0 g)、酵母粉0.5 g 加蒸馏水溶解至100 mL纯净水中，BHIS固体培养基琼脂粉浓度为1.5%；根据文献[16]配制CCFA培养基；根据文献[13]配制TY培养基；根据文献[17]配制TYG培养基。以上培养基均分别加入0.1%胆磺酸盐和1%半胱氨酸盐后121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。使用抗生素种类及浓度分别为氯霉素(15 mg/L)、克拉霉素(10 mg/L)、D-环丝氨酸(250 mg/L)和头孢西丁(8 mg/L)、四环素(20 mg/L)和氨苄青霉素(100 mg/L)。在需要时，额外加入10%胎牛血清(或5 %脱纤维羊血)，固体培养基配制时额外加入1.5%琼脂。以上所有培养基均121 ℃高压蒸汽灭菌30 min，所有抗生素均使用0.22 μm滤膜过滤除菌。

1.2.2艰难梭菌抗生素抗性实验 BHIS培养基中分别添加氨苄青霉素(100 mg/L)、氯霉素(15 mg/L)、D-环丝氨酸(250 mg/L)、头孢西丁(8 mg/L)、克拉霉素(10 mg/L)或四环素(20 mg/L)，再取相同浓度的艰难梭菌630纯培养物5 μL接种至含有不同抗生素的BHIS培养基中。设置不添加任何抗生素的BHIS培养基为对照，不同抗性培养基与对照均设置3个重复，37 ℃厌氧培养24 h后用细菌OD测量仪测量培养物浊度。

1.2.3艰难梭菌筛选培养基优化 首先，将艰难梭菌纯培养物分别接种至不同抗生素BHIS培养基中，以筛选艰难梭菌耐受的抗生素；其次，筛选BHIS、CCFA、TY、TYG培养基与血清、抗生素的组合对艰难梭菌和粪肠球菌混合菌种的分离效果；最后，筛选不同厂家生产的BHIS对艰难梭菌和粪肠球菌混合菌种的分离效果。混合菌液在不同培养基与抗生素、血清的组合中连续3次传代后将传代培养物划线至与液体培养基对应的固体培养基上，液体培养基接种量为5%。

1.2.4艰难梭菌的分离效果评价方法 (1)显微镜镜检，观察不同培养基中的粪肠球菌和艰难梭菌混合培养物是否存在粪肠球菌污染，拍照并选取每一种培养物的3个视野，计数视野中球菌和杆菌，根据不同培养基中的杆菌所占比例，评价各类培养基对艰难梭菌的分离效果；(2)菌落形态观察，混合培养物划线至固体平板上37 ℃培养18～24 h后，使用佳能G11相机拍照记录菌落形态，判断培养物是否为纯培养；(3)代谢产物气味判断，艰难梭菌在培养过程中会产生硫化氢气体、有特征性的臭鸡蛋气味，但粪肠球菌培养物无明显刺鼻气味。

1.2.5菌落16S rDNA测序及Blastn比对 将固体平板上形成的不同形态的单菌落使用PCR扩增16S rDNA并测序。扩增的引物为16S rDNA-F ∶GGAGGCAGCAGTGGGGAATA及16S rDNA-R ∶TGACGGGCGGTGTGTACAAG，反应聚合酶为诺唯赞®Green Taq mix。PCR条件：预变性一个循环95 ℃ 5 min，94 ℃变性 30 s、56 ℃退火 30 s、72 ℃延伸30 s，共30个循环，72 ℃继续延伸一个循环5 min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物后，送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果用使用Blastn程序比对16S rRNA数据库，以确定菌落种属(Basic Local Alignment Search Tool，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

2 结果

2.1 培养基筛选

艰难梭菌抗生素抗性实验结果显示，艰难梭菌对氯霉素、克拉霉素和氨苄青霉素敏感，对四环素、D-环丝氨酸和头孢西丁具有抗性，见表1。BHIS、TY、TYG培养基与各种不同抗生素及血清组合对艰难梭菌的富集效果显示，不添加血清的培养基均无艰难梭菌典型的微黄色菌体沉淀产生，且无臭鸡蛋气味；添加血清、头孢西丁或D-环丝氨酸的BHIS培养中有艰难梭菌典型的微黄色菌体沉淀产生，且伴有浓烈的臭鸡蛋气味；添加四环素培养基中有微黄色菌体沉淀生成，但沉淀量较少，且臭鸡蛋气味不浓烈；添加其他抗生素培养基均无菌体沉淀产生，见表2。在青岛海博、杭州微生物、北京索莱宝和杭州百思BHIS培养基中均加入10%血清、D-环丝氨酸和头孢西丁，在相同艰难梭菌接种量条件下，不同生产厂家BHIS培养基均有艰难梭菌典型的沉淀生成，并伴有浓烈臭鸡蛋气味，见表3。

表1 艰难梭菌抗生素抗性实验

注：“+”表示对此抗生素具有抗性，“-”表示对此抗生素敏感。

2.2 不同培养基中的菌体组成

以空白培养基作为镜检对照，纯化前艰难梭菌与粪肠球菌共培养物显微镜镜检可看到大量球菌和链球菌(约占70%)，少量杆菌(30%)，见图1A、1B；使用添加胎牛血清、D-环丝氨酸和头孢西丁的BHIS培养基(即BHIS-BDC培养基)筛选粪肠球菌和艰难梭菌混合物后，所有视野中无球菌，仅见杆状细菌，见图1C。

表2 不同培养基和抗生素组合对艰难梭菌的筛选作用

注：(1)沉淀类型中“MB”表示菌体呈米白色、易分散沉淀；“WH”表示菌体呈微黄色、细丝状沉淀；(2)“-”表示无沉淀产生或没有臭鸡蛋气味；“+”表示有臭鸡蛋气味，且“+”数量越多臭鸡蛋气味越浓。

表3 不同厂家BHI培养基对艰难梭菌分离效果

注：所有培养基中均加入D-环丝氨酸(250 mg/L)和头孢西丁(8 mg/L)及10%胎牛血清。

2.3 菌落形态

粪肠球菌与艰难梭菌混合培养物在BHIS平板上划线培养，BHIS培养基上可见光滑、凸起、1～2 mm的粪肠球菌菌落，艰难梭菌仅在平板边缘形成零星菌落，见图2A；混合菌液在BHIS-BDC培养基中连续传代3次，划线于BHIS-BDC平板上，37 ℃厌氧培养18～24 h，可见培养基表面形成典型艰难梭菌菌落(近圆形、表面粗糙、边缘不规则、菌落直径3～5mm)，见图2B。

注：A为空白培养基，B为艰难梭菌粪肠球菌混合培养物镜检，C为BHIS-BDC培养基分离纯化混合培养物后镜检；箭头所指(1)为链球菌，(2)为球菌，(3)为杆菌。

注：A为未纯化的粪肠球菌与艰难梭菌混合培养物在BHIS固体培养基上菌落形态，B为纯化后的菌株在BHIS-BDC固体培养基上菌落形态。

2.4 16S rDNA测序及Blast比对

在上述平板上分别挑取2个单克隆，PCR扩增其16S rDNA并送测序，结果表明1～2 mm菌落为粪肠球菌，3～5 mm直径菌落为艰难梭菌。见表4。

表4 16S rDNA序列Blast比对结果

3 讨论

从粪便标本中分离艰难梭菌是CDI诊断最直接的证据[18]。粪肠球菌作为人肠道主要菌群之一，能产生抑菌物质(如细菌素)，可以抑制沙门氏菌等病原菌的生长[19]。在临床检验实践中粪肠球菌极易造成艰难梭菌分离失败，延误对艰难梭菌携带者或已发展为CDI的患者的诊断。为了解决这一问题，本研究筛选不同生产厂家的BHIS培养基、不同抗生素以及是否在培养基中添加血液制品等条件对艰难梭菌分离的影响，结果表明是否在BHIS中添加血清(或脱纤维羊血)、D-环丝氨酸和头孢西丁是获得艰难梭菌纯培养的关键。虽然D-环丝氨酸和头孢西丁是艰难梭菌分离的常规抗生素[20]，但是血清(或脱纤维羊血)可以增加艰难梭菌分离效率尚未见报道。

抗生素敏感性实验结果显示，艰难梭菌对氯霉素、克拉霉素和氨苄青霉素敏感，对四环素、D-环丝氨酸和头孢西丁具有抗性，与文献报道一致[21]。不同培养基和抗生素组合对艰难梭菌的筛选结果显示，改良的BHIS-BDC培养基中有典型的艰难梭菌沉淀生成，并伴有浓烈臭鸡蛋气味，该结果表明用D-环丝氨酸和头孢西丁作为复合筛选抗生素比单一抗生素可以更有效地抑制粪肠球菌，添加羊血或者胎牛血清则能够提高艰难梭菌对粪肠球菌的竞争优势。产生这种现象的原因可能是粪肠球菌因对D-环丝氨酸和头孢西丁敏感，随着传代次数的增加而逐渐退化。另外，使用不同生产厂家BHIS培养基培养艰难梭菌时，菌体沉淀量和产生气味浓烈程度无明显区别，提示不同厂家的BHIS培养基对艰难梭菌的生长没有明显差异。

除了常见的BHIS、TY、TYG、CCFA培养基，有研究显示可以利用艰难梭菌选择培养基分离和培养艰难梭菌[22]；也有其他研究者使用商业化的马血CCFA培养基从水或者粪便中分离艰难梭菌[23]。但是由于国内目前对CDI的重视程度不如欧美国家，所以关于艰难梭菌配套产品还相对缺乏，且这些商业化的培养基价格昂贵，保质期短，本课题组尝试多种途径购买均未成功。因此，本研究选择BHIS、TY、TYG、CCFA培养基作为优化其起始培养基，研究结果表明单独使用国产BHIS、TY、TYG和CCFA培养基无法完全满足艰难梭菌生长所需营养，与国外报道差异明显[24-25]，这可能是国外培养基成分与国产培养基的成分存在差异有关。

在液体培养基中添加羊血会使观察菌体生长变得困难，因此在配制液体培养基时，本研究使用胎牛血清代替脱纤维羊血，借助D-环丝氨酸和头孢西丁对粪肠球菌的生长抑制，使艰难梭菌得以富集、纯化。值得注意的是，本研究结果提示了粪肠球菌在体外环境下对艰难梭菌具有强烈的抑制作用，这种抑制作用可能是粪肠球菌某种代谢产物产生的，该未知的代谢产物可能具有潜在的CDI治疗作用，即具有开发为CDI治疗药物的潜力。然而，代谢产物种类及其抑制艰难梭菌生长的机制尚待进一步研究。

综上所述，本研究通过对不同生产厂家的BHIS、不同抗生素及不同血液制品的组合，建立了稳定、简单的艰难梭菌分离方法，提示在BHI培养基中添加羊血和抗生素是去除艰难梭菌中粪肠球菌污染的关键，从而为后续的艰难梭菌生理、生化、致病性及基因功能研究奠定了基础。