饶凤琴， 吴昌学， 崔古贞， 程玉梅， 齐晓岚**， 洪伟**

(1.贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室&贵州省分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 基础医学院， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州医科大学附院 综合ICU， 贵州 贵阳 550004)

艰难梭菌(Clostridioidesdifficile)是一种革兰阳性、专性厌氧的产芽孢杆菌，是导致艰难梭菌相关性腹泻的主要原因[1]。艰难梭菌感染(Clostridioidesdifficileinfection，CDI)的临床表现可从轻度、短暂性、自限性腹泻到可危及生命的伪膜性结肠炎[2-3]。正常人体肠道内微生物处于平衡状态，抗生素的使用会扰乱肠道内微生物群落的平衡，进而导致有益微生物种类和数量减少，使有益微生物对艰难梭菌的阻遏效应被解除，艰难梭菌迅速占据肠道生态位，大量繁殖并产生毒素(tcdA、tcdB及二元毒素)，这些毒素攻击肠上皮细胞，导致肠道炎症，最终导致CDI的发生[4]。近年来，随着艰难梭菌强毒株核糖体027型的出现，CDI表现出高致死率和高复发率的特征，因而日益受到研究者的关注[5]。2011年，美国大约有近50万人感染艰难梭菌，约29 000人因CDI而死亡，2013年美国疾病控制与预防中心将C.difficile列为需要紧急控制的病原微生物[6]。对欧洲多个国家的研究数据显示，CDI确诊后30 d内CDI的死亡率从3%(法国)～30%(英国)不等[7]。所以，对艰难梭菌生物特性进行深入研究对防治CDI具有重要意义。研究发现，艰难梭菌黏附于宿主肠细胞表面对其进一步的定值、入侵以及毒力因子发挥作用尤为重要，如无法黏附于宿主细胞，便无法进一步的定植，将迅速被宿主细胞的非特异性防御机制清除，而艰难梭菌黏附过程由多种黏附因子共同作用。许多研究已经确定了涉及黏附和定殖过程的因素，如S层蛋白、黏附素Cwp66、鞭毛、热休克蛋白GroEL和水解酶等，影响这些因素的黏附因子中，目前已知的有细胞壁结合蛋白(Cwp6、Cwp8、Cwp2)、S层蛋白(SlpA)、细胞表面蛋白(Cwp66)、热休克蛋白(GroEL)、纤维连接蛋白(Fbps)、鞭毛蛋白(FliC、FliD)及脂蛋白(CD0873)等。研究这些黏附因子对于CDI的防治具有极其重要的意义，本文就黏附因子的研究进展进行综述。

1 细胞壁结合蛋白及S层蛋白(S-layer protein)

艰难梭菌细胞壁蛋白绝大多数属于细胞壁结合蛋白(cell wall binding proteins，CWPs)大家族，这个家族包括S层蛋白(S layer protein，Slp)、半胱氨酸蛋白酶Cwp84和相变蛋白CwpV[8]。Slp是细胞表面最丰富的蛋白质，艰难梭菌在其表面表达一个S层，在电镜下形成一个规则的二维阵列，每个菌株携带一个S层，由2种不同的蛋白质组成，一种是高分子量蛋白P47，另一种是低分子量蛋白P36，都由slpA基因编码。SlpA是S层蛋白之一，用粗制或纯化的SlpA预处理宿主细胞，或用抗SlpA血清培养艰难梭菌，均可显著减少艰难梭菌对细胞的黏附，表明该蛋白对艰难梭菌的黏附能力有影响[9-10]。细胞壁结合蛋白Cwp2，也是S层蛋白之一。艰难梭菌菌株cwp2基因缺失突变株对人克隆结肠腺癌细胞CaCo-2的黏附能力比野生型低(85.7±14.0)%。cwp2基因的失活还会导致毒素TcdA在体外释放增加，提示Cwp2在宿主细胞黏附中发挥重要促进作用[11]。最近的研究表明，在细胞黏附过程中，多糖与蛋白质的相互作用可能也发挥了重要作用。2008年，Ganeshapillai等[12]分析出艰难梭菌细胞表面多糖主要由五糖基(PS-Ⅰ)和磷酸六糖基(PS-Ⅱ)构成。Usenik等[13]发现CWP6与CWP8通过各自的三串联CWB2基序锚定到PS Ⅱ结构上。类似的机制在炭疽芽孢杆菌中也有报道，CWPs可通过S层同源(SLH)基序的伪三聚体排列与丙酮基化的次生细胞壁多糖非共价结合。与炭疽杆菌一样，艰难梭菌CWP-CWB-Motif形成三聚体，能够与PS-Ⅱ结合，可能是艰难梭菌与细胞壁结合蛋白识别，结合的关键结构[9-14]。用蛋白质三级结构预测软件Swiss-Model(https://www.swissmodel.expasy.org/)同源建模SlpA、Cwp6、Cwp8三级结构模型(图1)，Cwp6由3个CWB2基序串联组成，Cwp8中结构域2(CWB2)位于分子的左端，该结构域由残基K94-S175组成，由一条α螺旋，螺旋一侧的三条反平行β链和另一侧的发夹组成。SlpA与Cwp6，Cwp8具有同样的CWB2串联基序。胶原蛋白A，即CbpA属于附基质分子MSCRAMM家族，对胶原蛋白有黏附性，是艰难梭菌细胞壁锚定蛋白，可暴露在细菌表面，靶向人体肠道细胞胶原蛋白，从而对肠上皮细胞的黏附定植过程中具有一定程度的贡献[15]。以上这些说明细胞壁上的结合蛋白可能通过靶向识别并结合肠腺细胞上的信号蛋白使细菌的黏附能力增加。

注：A为SlpA，B为Cwp6，C为Cwp8。

2 细胞表面蛋白

Cwp66是艰难梭菌中第一个被发现并证明的黏附因子，也称为黏附素蛋白。2001年，Waligora等[16]研究证实艰难梭菌在经过60 ℃热激处理后黏附细胞能力的增强是由细胞表面蛋白Cpw66所介导，这种热激后黏附能力增加的现象，受到Cwp66抗体抑制。有趣的是Roberts[17]在2003年用反义RNA方法敲降艰难梭菌cwp66基因表达，发现敲降后的艰难梭菌在蛋白表达和黏附方面均无统计学差异。这个结果与Waligora等[16]的发现相悖，造成这种相悖结果可能的原因是反义RNA敲降cwp66的方法可能对该基因的表达抑制并不完全，cwp66完全敲除可能真正解开Cwp66蛋白功能的“神秘面纱”。

3 热休克蛋白

热休克蛋白(heat shock proteins，HSP)被认为是许多细菌病原体的主要抗原，一些微生物表达免疫原性GroEL(HSP60)同源物，会引起宿主免疫原性反应。抗生素的使用让肠道菌群结构紊乱，艰难梭菌抗生素压力状态，GroEL的表达会增加，GroEL表达上升会增加艰难梭菌细胞黏附能力[18-19]。

4 纤维连接蛋白

纤维连接蛋白(fibronectin)，是一种普遍存在于脊椎动物体液和细胞外基质中约450 kDa的糖蛋白。纤维连接蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein，Fbps)是一种黏附蛋白，主要存在于链球菌和葡萄球菌中。在革兰阳性菌中，Fbps暴露于细菌表面，通过甘氨酸(LPXTG)与细胞壁锚定。2003年，Hennequin等[20-21]发现艰难梭菌与纤维连接蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和玻璃体连接蛋白等细胞外基质蛋白结合，从而定植于宿主细胞。与纤连蛋白的结合是由于存在由fbp68基因编码的Fbps，介导了细菌与宿主细胞的纤维连接蛋白结合，使细菌附着在组织上。

5 鞭毛蛋白

鞭毛(flagellum)是许多细菌都具有的帮助细菌运动的器官，在很多病原菌产生毒素过程发挥了重要作用，如参与空肠弯曲杆菌和嗜肺军团菌的内化，参与空肠弯曲杆菌、幽门螺杆菌的细胞黏附及定植等[22-25]。一些研究者由此推测艰难梭菌在肠道的黏附定植与鞭毛相关蛋白有关，并做了一系列研究。Tasteyre等[26]提出鞭毛蛋白FliC与FliD参与了C.difficile与细胞的黏附过程。Dingle等[27]将编码FliC与FliD的基因fliC和fliD敲除后，艰难梭菌对肠腺细胞的黏附能力增加。Barketi等[28]将fliC失活后，艰难梭菌毒性基因表达会上调。这些研究说明了艰难梭菌鞭毛蛋白的存在对黏附过程有抑制作用，进一步推测鞭毛对细菌黏附有阻碍作用。

6 脂蛋白

脂蛋白对诸如绿脓杆菌，布鲁氏菌等病原菌与宿主细胞的黏附有关，为研究脂蛋白CD0873与艰难梭菌黏附的关系，研究者使用ClosTron系统构建了突变株，突变株对Caco-2(人肠腺上皮细胞系)细胞黏附能力显著降低，且CD0873抗体也能显著降低艰难梭菌对Caco-2细胞的黏附能力，显示了脂蛋白CD0873也参与了艰难梭菌的细胞黏附过程[29]。

7 总结与展望

近年来， CDI受到越来越多的重视，尤其是在中国，随着艰难梭菌院内感染病例报道逐渐增多，越来越多的学者把目光转移到CDI致病机制的研究[30-32]。艰难梭菌会导致抗生素性腹泻产生，严重者可发展为危及生命的伪膜性结肠炎。CDI过程中，艰难梭菌黏附于肠壁细胞是关键的步骤，当艰难梭菌黏附于肠上皮细胞后，细胞中某种因子激活艰难梭菌毒性基因，大量产生TcdA、TcdB及二元毒素CDT毒素，这些毒素进一步内化进入肠腺细胞，破坏正常的细胞连接，与宿主免疫系统发生相互作用，最终导致CDI的发生。艰难梭菌黏附定植于宿主细胞是由多种黏附因子介导，目前研究发现，细胞壁结合蛋白Cwp8、Cwp6、Cwp2，S层蛋白SlpA，细胞表面蛋白Cwp66，热休克蛋白GroEL，纤维连接蛋白Fbp68，鞭毛蛋白FliC、FliD，脂蛋白CD0873等参与了艰难梭菌与肠上皮细胞的黏附过程。这些黏附因子氨基酸组成中，大部分由赖氨酸主导，且环状折叠占比较多(42.1%～58.7%)，这提示了黏附作用可能和蛋白质的组成和折叠方式有关，但是具体的关联还亟待研究。对艰难梭菌黏附因子的作用进行研究，对于了解艰难梭菌吸附、入侵宿主和逃避宿主的免疫系统非常重要，这些黏附因子可以根据其功能制备成疫苗和各种检测试剂，如黏附因子FliC可做成疫苗，进行CDI的防治。目前，在仓鼠模型中以FliC胶囊作为口服疫苗预防CDI已经取得成功，若能够顺利应用到临床上，这将是一个防治CDI的重大突破[33]。而对于其他已知或未知黏附因子的研究，如黏附因子的表达调控过程、与细胞之间的相互作用，以及与毒素的表达调控关系尚不明确，还有待更加深入的研究。此研究的难点有2点：(1)艰难梭菌拥有的基因组过多，确定与CDI致病相关的基因种类、数量及名称极其困难；(2)对于基因功能的研究，基因敲除是一个非常重要的方式，而艰难梭菌基因敲除系统还不完善，有待研究者完善。