秦娟， 宋国林， 王建三, 林虹， 刘卿， 陈锦云， 王嫣**

(1.贵阳市妇幼保健医院 妇科， 贵州 贵阳 550003； 2.贵州省中医药大学第二附属医院 重症医学科， 贵州 贵阳 550003； 3.重庆医科大学 生物医学工程学院 省部共建国家重点实验室培育基地-重庆市超声医学工程重点实验室 重庆市生物医学工程学重点实验室， 重庆 400016)

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，传统治疗方法以手术、化疗及放疗为主，但患者生存率仍不理想，且这些传统治疗方法对尚未生育的育龄妇女影响较大；因此，寻求无创治疗宫颈癌是目前全球的研究热点[1-2]。目前，超声治疗被认为是目前肿瘤治疗的一种无创新方法[3]，已应用于慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样病变，甚至宫颈癌[4]。有研究发现，相比较于正常细胞，低强度超声更容易诱导肿瘤细胞凋亡，特别是恶性肿瘤细胞的凋亡更加明显[5-7]。HeLa肿瘤细胞株是宫颈癌细胞中具有代表性的人宫颈癌细胞，本研究采用低强度超声辐照对HeLa细胞进行照射、然后继续培养，于辐照后6 h及24 h时，采用Annexin V/PI双染法检测HeLa细胞的凋亡率，透射电子显微镜观察细胞的结构变化，Western blot测定细胞匀浆中半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-12(Casepase-12)蛋白表达水平，免疫组织化学法检测Caspase-12蛋白在HeLa细胞中的阳性表达率，探讨低强度超声对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞株 人宫颈癌HeLa细胞株购自上海中乔新舟生物科技有限公司，细胞培养于含有10%胎牛血清及1%双抗的高糖DMEM培养液中，于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养，每2～3 d传代1次，细胞密度约为5×105时进行后续实验。

1.1.2主要仪器 超声辐照仪(重庆海扶公司生产，超声功率输出0.5～5 W/cm2，可连续输出，频率9～10 MHz ，内置功率调节)，细胞培养瓶及细胞培养板购自美国Costar公司，倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司，CO2培养箱购自日本Sanyo公司，电泳仪购自美国Bio-Rad公司。

1.1.3主要试剂 高糖DMEM及胎牛血清均购自Gibco公司，CCK-8检测试剂购自碧云天生物技术有限公司，双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司，Anti Caspase-12和生物素标记的二抗、内参一抗、羊抗兔IgG等均购自美国Abcam公司，ECL增强化学发光检测试剂盒购自美国PIERCE公司，2.5%戊二醛溶液、1%四氯化锇、丙酮等均购自北京化工厂。

1.2 方法

1.2.1超声辐照 将对数生长期的细胞悬液调整浓度为1×109/L，每管2 mL。辐照处理组：超声探头固定于细胞辐照仪器底部，将细胞悬液放置于细胞辐照装置内、频率10 MHz、0.25 W/cm2，辐照10 s。研究设立对照组(细胞进行假照，辐照时间、辐照方式同辐照处理组)。

1.2.2细胞凋亡 采用Annexin V/PI双染法检测，将处于对数生长期的细胞,用筛选参数超声辐照后再置培养箱培养，于辐照后6及12 h收取细胞悬浮液,1 000 r/min离心5 min，丢弃上清液,加入1×Binding buffer 500 μL、Annexin V-FITC 5 μL及PI 10 μL,轻轻混匀，室温、避光反应15 min，1 h内进行流式细胞仪检测。

1.2.3细胞微结构观察 调整细胞浓度为1×108/L，3 000 r/min离心3 min，丢弃上清液，2%戊二醛固定后进行脱水。丢弃去残余脱水剂，室温下依次加入丙酮-EPON812包埋剂、纯包埋剂进行完全包埋，切片、干燥后用醋酸双氧铀染色液室温下染色10 min，铅染色液室温下染色12 min，冲洗并用滤纸吸干，透射电子显微镜观察细胞结构。

1.2.4细胞匀浆中Caspase-12蛋白水平 采用Western blot法检测，细胞裂解液提取细胞总蛋白质， BCA法测定蛋白质浓度,进行SDS-PAGE分离蛋白质，将蛋白质转移到 PVDF膜，5%的脱脂牛奶封闭2 h, 在4℃冰箱中使用一抗(稀释比例100 ∶1)孵育过夜,常温下使用辣根过氧化物酶标记的二抗孵2 h, 加入ECL曝光后进行半定量分析。

1.2.5Caspase-12蛋白阳性表达率 采用免疫组织化学法检测，制作细胞爬片、免疫组织化学染色前使用0.5%Triton X-100、3% H2O2处理细胞，PBS漂洗，一抗孵育(稀释比1 ∶100)4 ℃ 过夜(阴性对照用PBS液代替一抗)，加入二抗工作液37 ℃孵育30 min(Envision 两步法)，DAB显色10 min(避光，镜下观察至棕色)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞凋亡

Annexin V/PI双染法结果显示：与对照组HeLa细胞凋亡率比较，辐照后6 h时HeLa细胞凋亡率(46%)明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；辐照后24 h时HeLa细胞凋亡率(80%)增加更明显，差异有统计学意义(P<0.01)。图1。

2.2 细胞超微形态

电镜观察结果显示，与对照组(图2A)比较，辐照后6 h时HeLa细胞染色质固缩并凝结成块、出现凋亡小体(图2B，白色小框)，辐照后24 h时的HeLa细胞浆浓缩、内质网变疏松并与胞膜融合，形成空泡(图2C)。

对照组 辐照6 h 辐照24 h

2.3 细胞匀浆中Caspase-12 蛋白表达

Western blot结果显示，与对照组比较，辐照后6 h时HeLa细胞匀浆中Caspase-12 蛋白表达水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；辐照后24 h时增加更明显，差异有统计学意义(P<0.01)。图3。

A B

2.4 HeLa细胞中Caspase-12 蛋白阳性表达率

结果显示，Caspase-12在对照组细胞中无表达；在人宫颈癌HeLa细胞中的表达主要定位于胞浆，辐照后6及24 h时HeLa细胞中Caspase-12 呈阳性表达，可见胞浆内充满棕黄色颗粒；与对照组比较，辐照后6时HeLa细胞中Caspase-12 呈阳性表达率显著升高(P<0.05)；辐照后24 h更明显，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

注：与对照组比较，(1)P<0.05, (2)P<0.01。

3 讨论

超声波是一种非电离能量，由于超声对生物组织细胞特有的理化作用，其研究前景广阔。研究表明，超声可通过多种起始途径及信号传导系统诱导多种组织细胞凋亡。超声治疗已成为当今抗肿瘤的研究热点。肿瘤细胞、病变组织、细胞较正常细胞对超声更为敏感[8-11]。而近年来的研究发现诱导细胞凋亡是超声治疗肿瘤的重要生物学机制之一，其应用之一是采用低剂量超声[12]。有研究报告低能量超声可以诱导肿瘤细胞凋亡[13-15]。且研究表明低能量超声对不同肿瘤细胞的凋亡诱导时间与剂量有差别[16]。

诱导细胞凋亡是肿瘤治疗的机制之一。细胞发生凋亡时，细胞膜出现膜外翻现象，细胞皱缩，核固缩及染色质凝集，核碎裂、凋亡小体形成等。现大多采用流氏细胞术及投射电镜检测细胞凋亡[13,16]。已有研究发现，不同频率、强度超声导致细胞对其有应答反应，可能与细胞信号的调控及传导有关。而低强度超声在诱导细胞凋亡、细胞通透性增加、细胞结果改变方面研究也逐渐引起重视。已证实低频低强度超声会因对细胞的空化效应，导致细胞骨架、细胞膜表面形态、甚至染色体改变，从而选择性杀伤肿瘤细胞[17]。本研究结果显示，低强度超声可诱导宫颈癌细胞发生凋亡，在超声辐照6 h，流式细胞术检测到凋亡率为46%，投射电镜可见凋亡小体。并且随着时间延长，凋亡发生率达到80%(24 h)。临床研究表明CINⅠ级患者经聚焦超声治疗后3个月,宫颈局部组织中P16 和Ki-67的表达都降低，推测可能与凋亡有关[18]。本研究结果提示低强度聚焦超声介导细胞凋亡，并且随着时间延长，导致细胞死亡。

Caspase 家族是细胞发生凋亡的常见通路，而既往研究明确的是Caspase-12参与执行细胞凋亡步骤中是起主要作用的分子[19]。 超声刺激能使人宫颈癌细胞株存活率下降，既往对其机制的研究主要集中在依赖于Caspase的凋亡[20]。本研究中超声处理后用免疫组织化学和Western blot法检测凋亡相关蛋白Caspase-12 表达，结果发现，Caspase-12 表达随时间延长呈增加趋势，提示Caspase-12介导的凋亡信号可能参与了低强度超声辐照过程。这些结果暗示Caspase-12 被低强度超声辐照激活。然而，低强度超声辐照激活Caspase-12的具体机制尚不清楚。

超声对细胞的超声——生物学效应包括热效应和非热效应。非热效应包括声机械效应效应，超声空化、声化学效应[21-22]。既往研究已证实改变低强度超声的各种物理参数(频率、时间及强度)会影响受辐射细胞的结果，不同的超声辐照参数下对于不同的肿瘤细胞，发生的效应不同[23-24]。有学者认为低能量超声诱导肿瘤细胞凋亡发生的机制可能与空化效应和机械效应有关[3,11]。本研究采用低强度超声对细胞产生非热生物学效应诱导细胞凋亡，与既往研究一致。但低强度超声波作用的相关分子信号和关键蛋白质，诱导细胞凋亡的生理生化机制的仍然是难以捉摸的。考虑超声作为外界刺激，可能与低强度超声辐照激活宫颈癌细胞产生应激反应有关,继而启动细胞凋亡机制。目前还不清楚超声诱导细胞凋亡的具体途径。有研究报道，低强度超声诱导的细胞凋亡通路被认为是与线粒体途径有关[25]。因此，课题组下一步工作将考虑研究低强度超声诱导宫颈癌细胞凋亡的相关途径。

综上，本研究发现低强度超声辐照可以诱导人宫颈癌HeLa细胞细胞凋亡，并通过激活Caspase-12 表达增加，促进宫颈癌细胞凋亡。但对于超声诱导的宫颈癌细胞凋亡的深入分子机制，还需要进一步的分析，阐明低强度超声反应影响的分子信号通路。