孙建松

(贵州省人民医院耳鼻咽喉头颈外科，贵州 贵阳 520002)

先天性极重度感音神经性聋是影响人类健康和造成人类残疾的常见疾病[1]。研究[2]发现，大约60%的先天耳聋由遗传性因素导致。研究[3-9]发现，导致中国人群耳聋的三个最重要的致病基因SJB2、SLC26A4(PDS)和线粒体(mtDNA)12SrRNA(A1555G和C1494T)检出率分别为21%、14.5%和4.4%。目前临床上对重度和极重度感音神经性聋的惟一有效的治疗方法是人工耳蜗植入(cochlear implant，CI)。我院为配合中国残联贫困聋儿人工耳蜗抢救性康复项目的顺利启动和正确实施，在贵州地区率先开展CI手术，术前应用基因诊断技术对102例接受CI手术的极重度感音神经性聋患儿GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体12SrRNA突变位点进行检测，分析他们可能的致病基因。本研究基于对此类致聋基因与CI术后的疗效观察，初步探讨致聋基因与CI术后的相关性，为术前预估术后效果提供临床参考，也为建立和完善符合中国耳聋人群遗传特征的基因筛查提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2012年6月至2014年5月在我院接受单侧CI的儿童102例，其中语前聋98例，语后聋4例。根据耳聋基因检测结果分为两组：耳聋基因突变患儿组27例(观察组)，未检出耳聋基因突变患儿组75例(对照组)。患儿中男57例，女45例；植入年龄1～6岁，平均(2.2±1.6)岁。纳入标准：术前残余听力和术后康复条件较为接近，无围手术期并发症；手术均由同一术者完成，植入电极型号相同。术前行颞骨CT及颅脑MRI检查排除严重耳蜗畸形或大脑发育不良等智力精神障碍、排除心肺功能不良等影响全麻安全的因素。前庭水管扩大(LVAS)7例，有明确氨基糖甙类药物使用史3例，所有病例均未发现家族遗传史，其家庭散布贵州地区全境。在接受检测之前，所有受检者监护人均签署了耳聋基因检测知情同意书。

1.2耳聋基因突变分析

1.2.1基因组DNA提取 采取患儿外周血，采用天根生化科技(北京)有限公司生产的离心柱形血液基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Blood DNA Kit)提取静脉血中的全基因组DNA。除工作液外均保存于-80 ℃超低温冰箱中。

1.2.2遗传性耳聋中相关的9个突变位点的检测 采用博奥生物(北京)有限公司生产的九项遗传性耳聋基因检测试剂盒(Nine Deafness Gene Mutations Detection Kit)对中国人常见的4个耳聋基因9个突变位点(见表1)采用微阵列芯片法进行检测(详见使用说明书)。

1.2.3基因编码区测序 GJB2基因及GJB3基因编码区测序，参照文献[10]设计的引物序列合成测序引。SLC26A4基因引物序列及编码区测序方法参见文献[11]。线粒体DNA(mtDNA)基因引物序列及编码区测序方法参见文献[12]设计的方法。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火温度58 ℃下复性30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，反应终止后72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。扩增产物进行正向引物测序，发现序列变异者则进行反向引物测序证实。

1.2.4GJB2、GJB3、SLC26A4及mtDNA基因分析 PCR产物送北京天根生化科技有限公司进行正向引物测序，发现序列变异者进行反向引物测序证实。GJB2、GJB3、SLC26A4及线粒体基因测序结果应用Genetool Lite软件进行测定序列与标准序列的比对，标准序列参照GJB2：NM-004004；GJB3：NM-024009； SLC26A4：ENSG00000091137；mtDNA：Cambridge sequence，NC -001807。

1.3手术方法 采取圆窗入路。全麻成功后，患者取平仰卧位，术耳朝上，固定头部。以植入模板标记植入位置，耳后切口翻瓣，皮瓣和肌骨膜瓣相对翻开，暴露颅骨。准备植入床、电极通道以植入模板确定植入床位置，磨薄颅骨，准备与植入体大小相等的植入床，电极通道和固定小孔。圆窗开窗径路：首先切除乳突，暴露鼓窦入口及砧骨体，以此为标志，尽量削低面神经嵴，用小型金刚钻头在砧骨短脚、鼓索神经和面神经垂直段之间开放后鼓室，暴露砧镫关节及圆窗龛。植入人工耳蜗电极，小块筋膜封闭小孔，固定植入体，缝合皮肤。

1.4人工耳蜗植入术后疗效评估 参照听觉意义整合量表[13](MAIS)对学龄前儿童人工耳蜗植入术前后听觉能力的发展情况进行分析。使用T.P.Nikolopoulos 等[14]提出的听觉行为分级标准(CAP)和言语可懂度分级标准(SIR)评估聋儿康复效果。P.K.Kuhl[15]认为规范学语时期，即咿呀语爆发(babbing spurt)儿童发音的发育是儿童语言发育过程的里程碑。聋儿该阶段常常缺失或延迟。CI儿童术后该时期的出现标志着言语发育步入正轨。CI儿童术后定期调机时进行随访评估均由同一名听力师进行，随访至术后12个月。

1.5统计学方法 用SPSS16.0软件对评估结果进行统计学分析。组间数据差异统计学意义比较用Kruskal-Wallis Test检验及One Way ANOVA检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1耳聋基因突变检测分析 102例人工耳蜗植入患儿共检测到27例基因突变(28个致聋基因突变位点)。GJB2基因突变患儿中1例同时合并SLC26A4基因突变；线粒体12SrRNA 基因突变3例，其中2例为C1494T位点突变，1例为A1555G位点突变。在98例语前聋中共检测到23例致聋基因突变，分别为GJB2、SLC26A4和线粒体12SrRNA基因突变。4例语后聋患儿中均检测到致聋基因突变，SLC26A4基因突变2例，其中1例同时合并GJB2基因突变。3例有明确氨基糖甙类药物使用史患儿中，2例查出12srRNA C1494T基因突变。7例LVAS患者中，5例查出SLC26A4基因突变，突变率71.43%(5/7)，但1例Mondini畸形患儿未检测出基因突变。见表1。

表1 遗传性耳聋相关的9个突变位点及突变例数分布(n)

2.2CI术后1年听觉言语发育结果 两组患儿术后MAIS、CAP、SIR得分均较术前无明显改善(P>0.05)。观察组术后1年MAIS得分(21.980±4.458)分，CAP等级得分(5.788±0.498)分，SIR等级得分(5.526±0.898)分；对照组术后1年MAIS得分(23.120±2.186)分，CAP等级得分(5.298±0.899)分，SIR等级得分(5.122±0.898)分；两组差异均无统计学意义(均P>0.05)。术后规范学语出现时间的随访结果显示，观察组为(7.632±3.302)个月，平均为8个月，而对照组为(8.560±3.788)个月，平均为9个月左右出现，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注：①术前及术后1年MAIS随访结果；②术前及术后1年CAP随访结果；③术前及术后1年SIR随访结果；④术后规范学语出现时间随访结果。

图1CI术后1年听觉言语发育结果

3 讨 论

先天性耳聋的发病率为1/1 000，其中50%以上的患儿有遗传背景。聋病分子流行病学调查数据显示，GJB2、SLC26A4、线粒体12srRNA基因突变是导致中国遗传性耳聋的3个最常见的致病基因。随着耳聋基因研究及耳聋基因检测技术的进步，耳聋基因检测技术已经成为临床耳聋病因学分析的有力工具，耳聋基因突变作为CI术后的影响也逐渐成为研究人员关注的因素之一[16-17]。CI手术是一种能够帮助双耳重度/极度感音神经性聋患者获得听觉的最有效途径之一。

GJB2基因位于人类染色体13q12上，编码连接蛋白(connexin，Cx)26，与遗传性感音神经性聋有关，可引起非综合征性聋和综合征性聋[18]。本研究中，16例明确为由GJB2基因突变导致，总的突变率为15.69%(16/102)，其中35delG位点突变1例(0.83%)，176del 16和299del AT各3例(2.94%)，而235delC为9例(8.82%)，这可能与本组病例均为极重度感音神经性聋有关。研究[19]表明，GJB2基因突变导致的相关性耳聋病变位于耳蜗，但听觉通路及听神经基本正常，因此用人工耳蜗替代发生病变的耳蜗，从理论上说该类患者术后效果应该较好。Y.J.Yan 等[20]研究发现GJB2基因突变组听觉言语发育优于非基因突变及SLC26A4基因突变。本组102例患者行CI术后4周开机调试发现舒适阈特性与阈值无显著差异，随访发现GJB2基因突变组与其它基因突变组或非基因突变组相比听觉言语发育无明显差异，但其相关性仍需扩大样本量并需长期随访进一步证实。

GJB3突变可以导致常染色体相关的遗传性聋[21]，本研究未检测到538C>T位点突变患儿，这可能与本组样本较小及检测位点较局限有关。

SLC26A4基因又称PDS基因，定位于人类染色体7q31，编码的Pendrin蛋白含有780个氨基酸[22]。SLC26A4基因突变是目前公认的仅次于GJB2突变的引起感音神经性聋的遗传学病因[23]，也是我国导致感音神经性耳聋的主要原因之一，中国人群频发的热点突变是IVS7-2 A>G和2168A>G。本研究中携带SLC26A4基因2168A>G位点突变患者3例(2.94%)和IVS7-2A>G位点突变6例(5.88%)，而后者均表现为前庭水管扩大。SLC26A4基因表达于内淋巴管、内淋巴囊、椭圆囊、球囊等处，其表达区域较GJB2更广乏，因此，其突变造成的损害也更为广乏、直接，因此，CI效果理论上应该比GJB2患者差，这点从临床上也得到证实[20]，也与我们的初步随访结果相符。本研究显示，携带SLC26A4基因突变的聋儿，CI手术后在声场助听听阈、言语感知和识别等听觉言语功能方面的重建效果良好，但在术后的的各项评估测试中的表现与非基因突变组比较没有统计学差异。M.Gratacap等[24]研究认为SCL26A4与CI术后疗效无明显相关性，这与本研究结果相似。

线粒体性耳聋分为综合征型和非综合征型，以非综合征型耳聋较综合征常见，多与氨基糖甙类药物中毒性耳聋有关，尤其为1555腺嘌呤核苷向鸟尿环核苷突变(A1555G)[25-28]针对非综合征型耳聋个案的CI效果比较良好。在本研究中，发现3例线粒体DNA 12RsRNA 基因突变(2.94%)；而3例有明确氨基糖甙类药物史患儿中，2例检出12SrRNA C1494T基因突变。本研究结果显示在此类患儿CI术后的的各项评估测试中的表现与非基因突变组比较没有统计学差异，这可能与本研究样本较小，其相关性及突变比率需要进一步扩大样本量进行研究验证。

综上所述，遗传因素是耳聋的重要原因之一，多种致聋遗传学病因已明确，其中包括GJB2基因突变相关耳聋，SLC26A4基因突变相关耳聋和线粒体DNA相关耳聋。通过贵州地区耳聋基因检测，明确极重度感音神经性聋患儿的致聋基因，初步评估CI术后效果，为深入研究遗传性耳聋大群体以进一步验证耳蜗植入有效性提供参考。