汪育娟 杜鹃 江义笛 陈筑△

(1.贵阳市口腔医院牙体牙髓病科，贵州 贵阳 550001；2.东阳市中医院，浙江 金华 322100)

慢性牙周病是人类口腔疾病中最常见的感染性疾病之一，在我国35～44岁的成人中，慢性牙周病的发病率高达97.2%[1]。随着慢性牙周炎的不断进展，在牙周炎晚期时，可以因牙周支持组织及牙槽骨的大量丧失导致牙齿脱落，这也是目前我国成人失牙的首要原因。有研究[2]证实，在慢性牙周炎的发病过程中，宿主对致病菌的免疫应答的异常，与啮齿类动物慢性牙周炎发生、发展有密切的关系。因此，本实验通过检测慢性牙周炎小鼠模型中，免疫细胞—脾脏细胞表面分子的表达情况及小鼠血清中各型细胞因子的变化情况，探讨相关因子在牙周炎发展过程中的作用，为进一步理解慢性牙周炎的发病机制及免疫调节治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要实验试剂及仪器 脑心浸萃液态培养基(BHI，广州环凯)；氯化血红素(Sigma，美国)；抗酒石酸酸性磷酸酶染液(南京，建成)；FACS Calibur(Becton，Dickinson and Company，美国)；anti-mouse FITC-CD11b流式抗体(eBioscience，美国)；小鼠IFN-γ，IL-6，IL-10，TNF-α的ELISA检测试剂盒(深圳晶美)。

1.2实验动物和细菌菌株 选用健康C57BL/6小鼠，6～8周龄12只，雌性，无龋坏及牙周疾病，咬合关系正常。将小鼠分为两组，PBS对照组和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas.Gingivalis，P.Gingivalis)组。于室温、相对湿度平均为50%且通风、无菌条件下正常喂养饲料，自由饮水摄食。动物利用细菌(或PBS)持续感染1周：每天利用棉棒蘸取菌液涂抹于小鼠口腔及牙面、牙龈沟处，每次感染1 h后再给予食物和饮水。将P.GingivalisATCC33277接种于含0.5%氯化血红素的BHI血琼脂培养基上，于37 ℃厌氧培养箱(10% CO2、10% H2、80% N2)培养5～7 d，待培养基表面可见明显黑色菌落，革兰染色形态检查为纯培养物时，刮取菌落，重悬至BHI液体培养基内，培养24 h后，于紫外分光光度计600 nm处测定并计算细菌浓度(CFU/mL)。制备成109CFU/mL的菌液用于小鼠口腔、牙面和牙龈沟的感染。实验4周后，取小鼠外周血，将小鼠吸入CO2后处死取脾脏组织。

1.3流式细胞术检测脾脏细胞表面分子 分别取感染组、对照组小鼠的脾脏，制备成脾脏组织单细胞悬液，分别加入FITC标记抗CD11b抗体，4 ℃避光染色30 min后，250 g离心10 min，流式缓冲液洗涤3次。100 μL流式缓冲液重悬后，采用流式细胞仪检测，Flowjo 6.0软件分析流式细胞术结果。

1.4ELISA法检测小鼠血清中各型细胞因子的水平 利用内眦静脉取血的方法采集小鼠静脉血约1 mL，至于无菌不含抗凝剂的Ep管中，静置30 min，离心(3 000 rpm/min，10 min)，分离收集上层血清，分装后置于-20 ℃冰箱内冷冻保存。小鼠血清中IFN-γ，IL-6，IL-10，TNF-α含量的检测按照ELISA试剂盒说明说进行检测。

2 结 果

2.1小鼠脾脏细胞表面分子CD11b检测结果 小鼠脾脏细胞表面分子CD11b的表达均呈现中高表达的趋势，见表1。与对照组相比(图1)，感染组小鼠的脾脏细胞表面分子CD11b表达率显著高于对照组(P<0.05)。

图1 小鼠脾脏细胞表面分子CD11b表达率

表1 小鼠脾脏细胞表面分子CD11b表达率(%)

2.2小鼠血清中各型细胞因子水平的检测结果 小鼠血清中不同细胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-10的表达情况，见图2。与对照组相比，感染组血清中TNF-α和IL-6的表达水平均升高(P<0.001)，IFN-γ的表达水平下降(P<0.01)，IL-10表达水平下降(P<0.01)，差异具有统计学意义。

图2 小鼠血清中各型细胞因子的表达水平

3 讨 论

目前，较为公认的慢性牙周炎致病菌为牙龈卟啉单胞菌[3]，其分泌的毒力因子例如脂多糖、菌毛素和蛋白酶等与牙周炎的发病有着密切的相关性[4]。利用Pg感染动物模型口腔中的牙周组织，构建慢性牙周炎的动物模型也得到了很多学者的证实。慢性牙周炎的发生、发展及预后，与宿主T细胞的代谢和功能有着十分密切的联系[5-6]，通常认为宿主体内活化的CD4+T淋巴细胞可以通过产生多种不同类型的细胞因子对炎症和牙槽骨吸收的过程进行调节，这其中，已经有学者[7]证实了宿主体内TNF-α细胞因子的水平与牙槽骨吸收密切相关，同时，也有报道证明了IL-6等细胞因子水平的高低，与成人慢性牙周炎的发病程度有明显的相关性[8]。因此，研究动物慢性牙周炎发病过程中，体内细胞因子水平的变化，对于理解慢性牙周炎发病机制有很好的意义。

由于脾脏是体内T细胞贮存和活化过程中重要的器官，在不同生理或病理过程中，脾脏细胞中T细胞的活化水平可以在一定程度上代表体内T细胞水平的变化，因此，对脾脏细胞T细胞表面分子的研究有助于理解Pg感染小鼠后，动物体内T细胞活化水平的变化情况，也可以反映出宿主自身免疫细胞状态，提示T细胞被致病菌诱导活化过程中的变化情况。CD11b作为骨髓来源的未分化成熟的重要表面分子[9]，是衡量体内大量由骨髓发育而来的一系列未分化成熟细胞的重要标志物，本研究中获得的数据表明，在Pg感染的病理状态下，动物体内的免疫器官(如脾脏)会聚集大量由骨髓发育而来的未分化成熟的T细胞；同时，CD11b作为T细胞表面分子，在细胞间的识别和信号传导等方面也具有十分重要的作用，有研究证实了CD11b表面分子被封闭后，T细胞失去了其特有的增殖能力和免疫效应的能力，也显示出了这一表面分子的重要作用。

同时，由于细菌感染状态下，机体的免疫系统会分泌产生TNF-α和IL-6等促炎因子改变宿主的免疫反应，从而增加致病菌对宿主的易感性[10-11]，因此，需要对本动物模型血清中的TNF-α和IL-6细胞因子进行检测，以确定系统免疫系统的变化情况。另一方面，TNF-α也是牙周病原体感染机体后最先诱导出的促炎因子之一，参与了牙周病的早期发展，其又可以通过刺激破骨细胞形成、诱导牙槽骨破坏和结缔组织退化。IFN-γ、IL-10等细胞因子参与了造成机体牙周组织破坏的过程，因此也是慢性牙周炎发病过程中极为重要的指标[12-15]。

因此，本实验证实了慢性牙周病动物模型血清中，各型细胞因子的表达水平差异，提示了慢性牙周炎免疫状态及T细胞功能的变化情况；同时对脾脏细胞中T细胞表面分子CD11b的表达情况进行了研究，以期为慢性牙周炎发病机制提供更多的实验依据。

(本文图1见封三)