张丽霞 魏照辉 赵婉晴

摘要：利用响应面法对超声波辅助酶法提取桑叶总黄酮的条件进行优化，在单因素试验的基础上，选取料液比、提取温度和提取时间3个因素为自变量，以桑叶总黄酮提取率为响应值，进行Box-Behnken中心组合试验设计，进行响应面分析。结果表明，当加酶量为0.8%，超声功率为200 W，超声时间为10 min时，提取桑叶总黄酮的最佳工艺条件为料液比1 ∶ 18（g/mL），提取温度51 ℃，提取时间3.6 h，在此条件下总黄酮提取率为5.55%，总黄酮产量理论值与试验平均值相对标准误差为0.89%，表明Box-Behnken模型优化可用于桑叶总黄酮提取条件优化，所得参数准确可靠，具有实用价值。

关键词：桑叶;总黄酮;超声波辅助酶法提取;响应面法;提取率

中图分类号： R284.2  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）13-0217-05

桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥叶。近年来随着健康饮食的价值回归，桑叶已经被广泛应用于食品工业、医药、美容护肤等方面，呈现出古树新花的局面。桑叶含有矿物质、维生素、食物纤维、氨基酸、植物甾醇、黄酮类等多种功能性成分，具有降血糖、降血压、降低胆固醇、抗衰老、维持消化系统和排泄系统健康、防癌抗癌、提高免疫力等功效[1-4]。

桑叶具有上述功效，是因为其含有黄酮类、生物碱类、糖类，以及甾类、挥发油、氨基酸类、维生素和微量元素等有效成分，而黄酮类化合物和生物碱为主要功效成分，其中黄酮类化合物占桑叶干质量的1%～3%，具有降血脂、清除自由基、抗炎和抗癌等作用[5-8]。桑叶黄酮类化合物具有显著的抗癌、抗氧化作用，受到人们的广泛关注，其抗肿瘤作用主要表现在抗癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡和增强抑癌基因活性及抑制癌基因表达等方面[9-10]。因此，考虑到桑叶黄酮具有上述特殊功效，有必要对其提取工艺研究。

国内外对黄酮提取的研究较多，目前提取桑叶黄酮主要采用水、乙醇等溶剂进行提取，但该方法有提取率低、生产周期长的缺点。也有研究采用超声法、微波法和超临界CO2提取法提取桑叶黄酮。但从桑叶中超声波辅助酶法提取总黄酮的报道却并不多见。其中超声波辅助提取法是一种从植物中提取活性成分的重要方法[11-12]，近年来被广泛应用于植物活性成分的提取研究。超声提取相对于微波法提取和超临界CO2提取具有提取率高、速率快、能耗低的优点[13-14]。本研究采用超声波辅助酶法，在单因素试验的基础上，采用了 Box-behnken 中心组合设计，使用响应面分析法对桑葉总黄酮超声波辅助提取条件进行了优化。为更好地开发利用桑叶的药用食用价值提供合理的依据和参考。1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料与试剂：供试桑叶采摘于江苏省句容市桑树基地，经自然干燥后用粉碎机粉碎，过200目筛保存于4 ℃冰箱;芸香苷标准品购自国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠等试剂均为国产分析纯，购自天津市科密欧试剂有限公司。

仪器：UV-1600紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司生产;JJ500型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂生产;DHG-9053A电热恒温鼓风干燥箱，上海合恒仪器设备有限公司生产;电热恒温水浴锅，常州智博瑞仪器制造有限公司生产;TDL-5离心机，上海安亭科学仪器厂生产;JP-5OOB-2型高速多功能粉碎机，上海市久品实业有限公司生产;THZ-C-1台式冷冻振荡器，太仓市仪器设备厂生产;Synergy UV超纯水仪，南京双隆试验器材有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 桑叶总黄铜的提取 超声波辅助果胶酶法提取：准确称取0.5 g桑叶于100 mL蒸馏水中，加入果胶酶0.6%（质量分数），放入50 ℃的水浴锅中排气3 min，然后在50 ℃下超声辅助提取一段时间，准确吸2 mL提取液到离心管中，离心（10 000 r/min）5 min后得到澄清提取液。

1.2.2 桑叶总黄铜含量的测定 桑叶中总黄酮含量采用铝盐鳌合显色法测定[15]。准确称量80 mg芸香苷标准品，置于100 mL容量瓶中，用75%乙醇定容，配制成0.8 mg/mL的芸香苷标准液。然后芸香苷标准液和75%乙醇分别按照1 ∶ 1、1 ∶ 3、1 ∶ 7、1 ∶ 15体积比配制成0.40、0.20、0.10、0.05 mg/mL 芸香苷对照品溶液。510 nm处测定吸光度，以75%乙醇作空白对照。以吸光度为纵坐标，对照品的浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程：Y=1.0980X+0.003 2（R2=0.997 8），利用标准曲线计算样品总黄铜含量（C）。提取物总黄酮提取率公式：

W=（CV/m）×100%。

式中：W为黄酮提取率（%）;V为提取液的总体积（mL）;m为称量的桑叶粉的准确质量（g）。

1.2.3 单因素试验 （1）加酶量对提取效果的影响 在固定料液比1 ∶ 10（g/mL），提取温度60 ℃，提取时间2 h，超声功率200 W，超声10 min条件下，考察不同加酶量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）对桑叶中总黄铜提取率的影响，筛选出最佳的加酶量。（2）料液比对提取效果的影响 在固定加酶量0.8%，提取温度60 ℃，提取时间2 h，超声功率 200 W，超声10 min的条件下，考察不同料液比（1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25）对桑叶中总黄铜提取率的影响，筛选出最佳的料液比。（3）提取温度对提取效果的影响 在固定加酶量0.8%，料液比1 ∶ 10（g/mL），提取时间2 h，超声功率200 W，超声10 min的条件下，考察不同提取温度（40、45、50、55、60 ℃）对桑叶中总黄铜提取率的影响，筛选出最佳的提取温度。（4）提取时间对提取效果的影响 在固定加酶量 0.8%，料液比1 ∶ 10（g/mL），提取温度60 ℃，超声功率 200 W，超声10 min的条件下，考察不同提取时间（1、2、3、4 h）对桑叶中总黄铜提取率的影响，筛选出最佳的提取时间。（5）超声波功率对提取效果的影响 在固定加酶量0.8%，料液比1 ∶ 10（g/mL），提取温度60 ℃，超声10 min的条件下，考察不同超声功率（150、200、250、300、400 W）对桑叶中总黄铜提取率的影响，筛选出最佳的超声波功率。

1.2.4 响应面试验设计 在单因素试验结果基础上，固定加酶量0.8%，超声功率200 W，超声10 min等条件，采用Box-Behnken试验设计，以选取料液比、提取温度和提取时间3个因素为自变量，以桑叶黄酮提取率为响应值，进行Box-Behnken試验，以-1、0、1分别代表自变量的低、中、高3个水平，试验因素水平及编码见表1。

1.2.5 数据处理 采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 加酶量对桑叶总黄酮提取率的影响

由图1可知，随着加酶量的增大，总黄酮的提取率逐渐增大，当加酶量大于0.6%后总黄酮提取率差异不显著，说明此时酶已经达到饱和，为了避免酶的浪费而造成成本加大，因此选择最佳加酶量为0.6%。

2.2 料液比对桑叶总黄酮提取率的影响

由图2可知，随着液料比的增大，桑叶总黄酮的提取率逐渐提高，这主要是由溶剂能够溶解的黄酮的量不断增加所致[16]。当液料比达1 ∶ 20时，再增加溶剂用量，提取率提高不明显，因此选择最佳液料比为1 ∶ 20。

2.3 提取温度对桑叶总黄酮提取率的影响

由图3可知，随着提取温度的升高，总黄酮提取的提取率呈现逐渐增大的变化趋势，这主要是由于温度升高，加剧了黄酮分子运动及相互间的碰撞频率，促进植物细胞破裂[17]，有助于黄酮渗出扩散到溶剂中。但是温度增加至50 ℃时，再升高温度对总黄酮的提取率影响不明显。因此从节能和提高提取效率的角度考虑，选择最佳提取温度为50 ℃。

2.4 提取时间对桑叶总黄酮提取率的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，总黄酮提取率逐渐增大，当提取时间为3 h时，总黄酮的提取率为4.52%，继续延长提取时间，总黄酮的提取率变化不大。理论上提取时间越长，原料与提取剂的接触越充分，提取也越充分。但是时间延长会增加试验周期。因此本试验将提取时间确定为3 h。

2.5 超声功率对桑叶总黄酮提取率的影响

由图5可知，当超声功率小于250 W时，总黄酮的提取率随超声功率的升高而升高，250 W时总黄酮的提取率达到最大，当超声功率大于250 W时总黄酮提取率明显下降。因此，选用超声功率为250～300 W。

2.6 回归方程的建立与方差分析

Box-Behnken试验设计及结果见表2。以总黄酮提取率（Y）为指标，利用Design-expert 8.0.1 Trial数据处理软件中ANOVA程序对表2的试验结果进行二次回归分析，计算出方程各项系数并进行方差分析，可得3个因子与Y之间的回归方程（模型）为

Y=5.520+0.069X1+0.030X2+0.099X3-0.020X1X2-0.067X1X3-0.015X2X3-0.130X12-0.095X22-0.067X32。

由方差分析（表3）可以看出，所得Y1的回归方程极显著（P<0.01），且R2>0.9，失拟项F检验不显著（P>0.05），说明回归方程拟合度好，模型显著（P<0.01），该回归模型可用于试验结果分析。料液比和提取时间对桑叶总黄酮提取率的影响极显著（P<0.01），提取温度对桑葚叶总黄酮提取率的影响不显著（P>0.05）。二次项X12、X22以及交互项中的X1X3也对桑叶总黄酮提取率的影响显著（P<0.05）。这表明各试验因素对总黄酮提取率的影响呈二次关系，且3个因素之间存在交互作用。

2.7 响应面分析

2.7.1 响应面各因素间交互作用的优化分析 响应面的图形是可以反映各试验因子对响应值的影响，而等高线图能反映最优条件下各试验因子的取值以及各因子之间的交互作用。圆形等高线表示2个因素交互作用不显著，而椭圆形等高线表示2个因素交互作用显著。

料液比和提取温度2个因素对总黄酮提取率的交互作用见图6。由响应面图可知，X1、X2 2个因素的交叉项显著，料液比约在（1 ∶ 18、1 ∶ 20），提取温度约在（45、50 ℃），二者存在显著增效作用，呈现正相关关系;而料液比约在（1 ∶ 20、1 ∶ 23），提取温度约在（50、55 ℃），桑叶总黄酮提取率随二者的增加而降低。由等高线图可知，总黄酮提取率最大为5.58%。

料液比和提取时间2个因素对总黄酮提取率的交互作用见图7。由图7可知，X1、X3 2个因素的交叉项显著，在料液比约在（1 ∶ 18、1 ∶ 20），提取时间约在（2、4 h），二者存在显著增效作用，呈现正相关关系。由等高线图可知，总黄酮提取率最大为5.53%。

提取温度和提取时间2个因素对总黄酮提取率的交互作用见图8。由图8可知，X2、X3 2个因素的交叉项显著，在提取温度约在（40、45 ℃），提取时间约在（2、4 h），二者存在显著增效作用，呈现正相关关系。由等高线图可知，总黄酮提取率最大为5.49%。

2.7.2 模型的验证 为了检验响应面法优化桑叶提取总黄酮工艺结果的可靠性，根据得到的优化条件进行3次验证试验，结果显示，试验平均值为5.55%，与预测的最大响应值相对标准偏差为0.89%，表明Box-Behnken模型优化可用于桑叶总黄酮的提取条件优化，所得参数准确可靠，具有实用价值。

3 结论与讨论

桑叶黄酮的提取方法有多种[18]，牟会荣等采用响应面法就提取时间、提取度、乙醇浓度和液料比4个因素进行桑叶黄酮提取工艺的优化，所得最佳提取工艺为提取温度68 ℃、提取时间40 min、乙醇浓度52%和液料比86 mL/g，此条件下桑叶黄酮得率为4.71%，而理论预测值为4.64%[19]。田刚等利用均匀设计法对超临界CO2流体提取桑叶黄酮的工艺进行优化，结果表明，超临界CO2流体提取桑叶黄酮的最佳提取条件为提取温度51 ℃，提取压强36 MPa，提取时间4.0 h，夹带剂乙醇用量3.7 mL/g，在此条件下测得的桑叶黄酮的提取率为1.42%[20]。本研究在单因素试验的基础上，采用超声波辅助酶法提取桑叶总黄酮，并采用响应面法对提取工艺进行优化，获得的桑叶总黄酮最佳提取工艺条件为料液比1 ∶ 18，提取温度51 ℃，提取时间3.6 h，在此条件下总黄酮提取率为5.55%，总黄酮产量理论值与试验平均值相对标准误差为 0.89%，表明Box-Behnken模型优化可用于桑叶总黄酮的提取条件优化，所得参数准确可靠，具有实用价值。与传统的有机溶剂回流提取法、超临界CO2提取法相比，本方法具有安全无毒、成本低、提取率较高、操作简单的特点。

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