王蕴倩 薛磊 李慧聪 时军 陈宝平

(河南大学淮河医院 1肾内科，河南 开封 475000；2内分泌科)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的并发症之一，也是糖尿病死亡的主要原因〔1,2〕。目前糖尿病的发病率正逐年上升，DN的发生也逐渐增多〔3〕。miRNA是一种小的非编码RNA，长度为20～25个核苷酸，通过碱基互补配对方式与靶基因3′UTR部分或完全互补，在转录后水平调控靶基因的表达〔4〕。据报道，多种miRNAs的表达与DN的发生发展有关〔5〕，其中包括miR-192〔6〕、miR-377〔7〕、miR-21〔8〕。有研究报道，在冠状动脉〔9〕、人急性白血病〔10〕、红斑狼疮〔11〕等多种疾病中miR-92a-3p均出现异常表达。但miR-92a-3p在DN中的作用机制尚未完全清楚。G蛋白耦联受体(GPR)124为GPR家族的孤儿受体，其与血脑屏障、血管生成关系密切〔12,13〕。孤儿受体GPR124、GPR88参与大鼠的高血压形成〔14〕，但GPR124在DN中的调控机制尚未十分清楚。本研究拟以高糖诱导的小鼠损伤足细胞为研究对象，检测miR-92a-3p、GPR124在高糖诱导的损伤小鼠足细胞中的表达，观察抑制miR-92a-3p、过表达GPR124、敲减GPR124对高糖诱导的损伤小鼠足细胞中结蛋白(Desmin)表达和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料 永生型小鼠足细胞购自美国ATCC；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国GIBCO公司；LipofectamineTM2000、聚氰基丙烯酰正丁酯(BCA)蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自德国罗氏诊断有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)试剂盒、电化学发光法(ECL)发光液和放射免疫沉淀试验(RIPA)蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司；脂膜蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2细胞培养及模型的构建 用含10 %胎牛血清的RPMI1640完全培养基培养永生型小鼠足细胞，置于37℃,5% CO2的培养箱中常规培养。按照邢玲玲〔15〕的方法建立高糖诱导的小鼠足细胞损伤模型。运用Western印迹、流式细胞术检测损伤足细胞中Desmin的蛋白表达及凋亡率。

1.3细胞转染与分组 将anti-miR-92a-3p、anti-miR-NC、pcDNA、pcDNA-GPR124、anti-miR-92a-3p+si-con、anti-miR-92a-3p+si-miR-92a-3p按照脂质体LipofectamineTM2000说明书操作步骤转染至小鼠足细胞，然后用高糖30 mmol/L处理48 h，分别标记为高糖+anti-miR-92a-3p组、高糖+anti-miR-NC组、高糖+pcDNA组、高糖+pcDNA-GPR124组、高糖+anti-miR-92a-3p+si-con组、高糖+anti-miR-92a-3p+si-GPR124组，转染48 h后，用qRT-PCR检测转染效率。转染成功后，用于后续试验。

1.4qRT-PCR实验 取适量对数生长期1.3各组细胞，遵照RNA抽提试剂盒说明书要求提取RNA进行定量，然后按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。最后按qRT-PCR试剂盒说明书进行miR-92a-3p和GPR124检测。用2-△△Ct计算miR-92a-3p和GPR124的表达。

1.5Annexin V-FITC/PI流式细胞术实验 将1.3各转染组细胞，用结合缓冲液 500 μl悬浮细胞，分别加入5 μl的 Annexin V-/ FITC和PI，混匀，室温避光静置15 min。采用流式细胞仪测定。细胞的凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品重复3次。

1.6Western印迹实验 收集1.3各组细胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min离心10 min，取上清置于EP管，加入5×SDS上样缓冲液，沸水煮沸10 min。电泳后用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉将膜封闭2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃过夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加发光液，曝光。

1.7双荧光素酶报告基因检测实验 荧光素酶报告载体(psiCHECK2-GPR124-WT,psiCHECK2-GPR124-MUT)分别与miR-92a-3pmimics、miR-NC用脂质体法转染小鼠足细胞，培养6 h后，更换新鲜培养液继续培养，转染48 h。按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书步骤操作。结果以海参荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度的比值反应miR-92a-3p与GPR124的结合力。

1.8统计学处理 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1高糖刺激对小鼠足细胞损伤的影响 与对照组(0.32±0.04、6.47%±0.53%)相比，高糖组Desmin蛋白表达(0.86±0.07)显著升高，细胞凋亡率(24.13%±1.76%)显著升高(t=11.601、16.641，均P=0.000)。

2.2抑制miR-92a-3p对高糖刺激小鼠足细胞损伤的影响 与高糖+anti-miR-NC组相比，高糖+anti-miR-92a-3p组miR-92a-3p、Desmin蛋白表达显著降低，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见表1，图1。

2.3敲减GPR124表达逆转了抑制miR-92a-3p对高糖刺激小鼠足细胞损伤的保护作用 与高糖+anti-miR-92a-3p+si-NC组(0.34±0.03，9.46%±1.37%)相比，高糖+anti-miR-92a-3p+si-GPR124组Desmin蛋白表达(0.69±0.07)显著升高，细胞凋亡率(18.49%±1.42%)显著升高(P<0.05)，且高糖+anti-miR-NC组、高糖+anti-miR-92a-3p组、高糖+anti-miR-92a-3p+si-NC组、高糖+anti-miR-92a-3p+si-GPR124组Desmin蛋白表达、凋亡率差异有统计学意义(F=46.406、61.995，均P=0.000)，见图1。

2.4高糖刺激对小鼠足细胞中miR-92a-3p和GPR124表达的影响 与对照组相比，高糖组miR-92a-3p表达显著升高，GPR124蛋白表达显著降低(图2)，GPR124 mRNA表达显著降低(P<0.05)。见表2。

2.5GPR124过表达对高糖刺激小鼠足细胞损伤的影响 与高糖+pcDNA组相比，高糖+pcDNA-GPR124组GPR124蛋白表达显著升高，Desmin蛋白表达显著降低(图3)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见表3。

表1 抑制miR-92a-3p对高糖刺激小鼠足细胞损伤的影响

图1 Desmin蛋白表达

图2 GPR124蛋白表达

表2 高糖刺激对小鼠足细胞中miR-92a-3p和GPR124表达的影响

图3 GPR124和Desmin蛋白表达

组别GPR124蛋白Desmin蛋白凋亡率(%)高糖+pcDNA组0.17±0.040.89±0.0823.76±2.06高糖+pcDNA-GPR124组0.61±0.050.41±0.0414.77±1.34t值11.9029.2956.336P值0.0000.0010.003

2.6miR-92a-3p靶向调控GPR124的表达 运用miRcode数据库预测到miR-92a-3p与GPR1243′UTR存在结合位点(图4)；双荧光素酶活性检测结果显示，与miR-NC组(1.02±0.08、0.98±0.09)相比，miR-92a-3p组WT-GPR124细胞中荧光活性(0.43±0.04)显著降低(t=11.425,P=0.000)，MUT-GPR124细胞中荧光活性(1.01±0.07)不受影响(t=0.456,P=0.672)；与miR-NC组(0.57±0.06)相比，miR-92a-3p组细胞中GPR124表达(0.21±0.03)显著降低，与anti-miR-NC组(0.53±0.05)相比，anti-miR-92a-3p组(0.97±0.08)显著升高(P<0.05),且4组比较差异有统计学意义(F=86.925，P=0.000)。

图4 GPR124的3′UTR中含有与miR-92a-3p互补的核苷酸序列

3 讨 论

DN、肾小球硬化、膜性肾病均可引起足细胞疾病，足细胞的变化在此过程中具有关键作用〔16〕。足细胞受损导致其从基底膜脱落，毛细血管袢塌陷，细胞外基质增多，最终血管袢受阻，引发肾脏疾病，因此足细胞数量的降低与DN的进程呈正相关〔17,18〕。在建立动物模型试验中，高糖是常用的经典糖尿病诱发物。高燕等〔19〕、苏宁等〔20〕运用链脲佐菌素建立DN模型，本研究用高糖30 mmol/L处理永生型小鼠足细胞48 h建立了高糖诱导的足细胞损伤模型，且模型构建成功。

有研究表明，miRNA对细胞的增殖、分化、凋亡具有重要作用，其可能参与人类的肾病、尿毒症、DN等多种疾病的发生发展〔21,22〕。miR-223-3p在2型DN进展中具有重要作用，其可作为诊断DN的新型标志物〔23〕。詹学良等〔24〕研究报道，miR-92a的表达量与足细胞的损伤程度呈正相关，推测miR-92a可能参与肾脏细胞的损伤。杨竣〔25〕构建了稳定敲减miR-92a的主动脉内皮细胞，治疗后可促进糖尿病大鼠勃起，上调内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和Dickkopf相关蛋白(DKK)3的表达，揭示miR-92a-inhibition可促进糖尿病大鼠的勃起。张成银等〔26〕研究发现，miR-92a的表达与DN呈正相关，提示miR-92a参与DN的发展。本研究发现，miR-92a-3p高表达，且抑制miR-92a-3p可下调Desmin和细胞凋亡，保护足细胞损伤；深入研究发现，miR-92a-3p可靶向负调控GPR124。

GPR是一类受体超家族，其在机体的多种生理功能中具有重要作用〔27,28〕，其特征为受体结合配体后，仅能通过G蛋白转导，再由第二信使将信号传至效应器〔29〕。近年研究报道GPR在DN的进程中起关键作用〔30〕。GPR124为GPR家族的一种孤儿受体，其在转化生长因子(TGF)-β通路、β-catenin通路中均具有重要作用〔31〕。王薪宁等〔32〕报道，GPR 119、40、120均可作为抗糖尿病药物的作用靶点。陆杨等〔33〕研究报道，螺内酯可抑制DN大鼠中GPR激酶(GRK)2、GRK3、GRK4的表达，促进GRK6、GPR17的表达，提示螺内酯可调控DN大鼠GRKs和GPR17的表达。段倚琦〔34〕发现，GPR124在DN组细胞中低表达，且沉默GPR124可促进足细胞受损，过表达GPR124可通过增强细胞的自噬功能发挥保护足细胞的功能。本研究发现，GPR124低表达，进一步过表达GPR124发现，其可促进抑制Desmin的表达，下调细胞凋亡率；深入研究发现，敲减GPR124表达可逆转抑制miR-92a-3p对高糖刺激小鼠足细胞损伤的保护作用。

综上，miR-92a-3p可保护高糖诱导的小鼠足细胞损伤，其机制可能与靶向调控GPR124有关，为糖尿病肾病的靶向治疗提供新靶点。