陶朝阳，邢心睿，陈 思，曹 奇，丁德英，朱臻宇

(1.西藏军区总医院药物制剂研究中心，西藏 拉萨 8500071；2.海军军医大学药学院，上海 200433；3.解放军第210医院，辽宁 大连 116000)

扶正化瘀胶囊(旧名肝平胶囊、扶正化瘀方、319方)是由上海中医药大学经过20余年研究，采用现代技术自主研发生产的复方中成药，该方由丹参、桃仁、五味子、冬虫夏草、绞股蓝、松花粉六味药材组成，丹参在方中活血祛瘀作为君药；冬虫夏草补虚损、益精气，桃仁助丹参活血祛瘀，共为臣药；松花粉益气润燥，绞股蓝清热解毒，共为佐药；五味子味酸，为引经使药[3-4,10,16]。该药针对肝纤维化血瘀研制，临床治疗效果显著，是国家“八五”科技攻关成果，受国家发明专利保护，已获得国家中药Ⅲ类新药证书。扶正化瘀片于2006年通过美国食品和药品监督管理局审批，免于Ⅰ期临床，直接进入Ⅱ期临床实验；2013年该复方圆满完成Ⅱ期临床实验，使扶正化瘀片成为肝病领域第一个通过美国Ⅱ期临床试验的中成药，也有望成为首个获准进入美国主流医药市场的复方中药。

该复方在我国已使用多年，但由于其组分复杂，一直缺乏系统性研究，尽管目前关于该复方作用机制的报道较多[1-2,5-8]，但是整个复方的化学成分还未见报道。因此，明确扶正化瘀胶囊各个组分的化学成分对于深入研究该复方治疗效果、阐明各个组分发挥作用的机制疗效具有重要意义。

UHPLC和Q-TOF/MS的串联技术在中药复方等复杂体系研究中占有一定优势，该技术集色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏、高分辨、强定性能力于一体，已经成为中药复方化学成分分析和鉴定的有效手段之一[12-14]。本实验采用UHPLC-QTOF/MS技术首次对扶正化瘀胶囊中的化学成分进行快速分析，并对各个成分进行药材归属，进一步阐明了扶正化瘀胶囊的药效物质基础，具有重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290 Infinity 液相系统，包括G4220A四元泵、G4226自动进样器G1316C柱温箱(安捷伦科技有限公司，美国)；Agilent 6538 UHD and Accurate-Mass Q-TOF/MS质谱仪，配有标准电喷雾离子源(ESI)及MassHunter Qualitative Analysis Software 分析工作站(安捷伦科技有限公司，江苏南京)；JY10001十万分之一电子天平(精密科学仪器有限公司，上海)；Heal Force SMART-N 超纯水机(力康生物医疗科技控股有限公司，香港)；Micro 17高速离心机(Thermo Fisher Scientific，美国)；甲醇、乙腈均为色谱纯(Merck，德国)，甲酸为色谱级(ROE scientific INC，美国)，水为实验室制备的超纯水，其他试剂均为分析级。

1.2 药品与试剂

丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、丹酚酸A、丹参酮ⅡA、苦杏仁苷、腺苷、虫草素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子酯甲、山柰酚对照品(一飞生物科技有限公司，上海，纯度≥98%)。扶正化瘀胶囊(上海黄海制药有限责任公司)购自益丰大药房，批号：161220、170640、171116。

1.3 对照品溶液制备

分别用毛细管蘸取约0.1 mg的丹酚酸B、二氢丹参酮I、丹酚酸A、丹参酮ⅡA、苦杏仁苷、虫草素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子酯甲、山柰酚对照品置于200 μl的甲醇溶液中制成对照品混合溶液。

1.4 供试品溶液制备

精密称取扶正化瘀胶囊内容物0.5 g，置于25 ml棕色具塞量瓶中，加入25 ml甲醇适量溶解，超声(功率：300 W，频率：40 kHz)处理60 min，补足减失的甲醇，室温放置20 min，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液于离心管中，于16 000 r/min离心10 min，取上清液，即得扶正化瘀胶囊样品溶液。

1.5 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLCHSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters Corporation，Ireland)。流动相采用0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)。梯度洗脱条件：0～3 min，2%B；3～18 min，2%～50%B；18～22 min，50%～95% B；22～25 min，95%B。平衡时间为10 min，流速为0.4 ml/min，分析所用时间为25 min。进样体积设置为3 μl，柱温箱温度为40 ℃，自动进样器的温度为4 ℃。

1.6 质谱条件

电喷雾离子源采用正/负离子模式。正离子模式条件：毛细管电压4 V；干燥气体流速11 L/min；干燥气体温度350 ℃；雾化器压力45 psig；碎片电压120 V；Skimmer电压60 V。质谱采集范围100～1 100m/z，参比离子m/z为121.0509。

1.7 扶正化瘀胶囊化学成分数据库的建立

根据国内外已有的专业数据库TCM@taiwan、TCMID(traditional Chinese medicine integrative database)和上海中科院化学专业数据库及相关研究文献，共收集了扶正化瘀胶囊六味药材中801个化学成分。利用Agilent公司研发的Formula-Database-Generator软件，通过各化学成分包含碳、氢、氧的个数，计算化合物精确的相对分子质量，建立化学成分的分子式和相对分子质量的数据库。

2 结果与讨论

2.1 试验条件优化

对于样品提取溶剂，本实验首先采用了乙腈和甲醇2种提取溶剂，结果发现甲醇提取样品的峰容量明显高于乙腈，而且部分的主峰响应也更佳，故放弃了使用乙腈溶剂的提取方法。

关于色谱条件考察，本实验比较了甲醇-水和乙腈-水，实验结果显示乙腈-水的洗脱系统优于甲醇-水，而且各峰之间的分离效果更好。加入0.1%的甲酸可以提高峰响应，还可以改善峰拖尾，因此采用0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液的洗脱系统。

2.2 扶正化瘀胶囊总离子流图

精密吸取扶正化瘀胶囊供试品溶液和对照品混合溶液200 μl置进样小瓶，按照上述色谱和质谱的测试条件进行样品分析，得到扶正化瘀方样品溶液正、负离子模式下的总离子流图，如图1所示。

图1 扶正化瘀胶囊供试品TOF/MS总离子流图 A.正离子模式；B.负离子模式1.丹酚酸B；2.二氢丹参酮I；3.丹酚酸A；4.丹参酮ⅡA；5.苦杏仁苷；6.虫草素；7.五味子醇甲；8.五味子乙素；9.五味子酯甲；10.山柰酚

2.3 利用对照品鉴别扶正化瘀胶囊中的化合物

实验中利用已有的对照品，无差别鉴别出丹酚酸B(峰1)、二氢丹参酮Ⅰ(峰2)、丹酚酸A(峰3)、丹参酮ⅡA(峰4)、苦杏仁苷(峰5)、虫草素(峰6)、五味子醇甲(峰7)、五味子乙素(峰8)、五味子酯甲(峰9)、山柰酚(峰10)，对照品混合溶液正离子模式下的总离子流图如图2A，丹参酮ⅡA、二氢丹参酮Ⅰ在扶正化瘀胶囊供试品和对照品混合溶液正离子模式下提取离子流图，如图2B、图2D和图2C、图2E。

2.4 化合物鉴别的方法

以正离子模式下4号峰丹参酮ⅡA为例介绍扶正化瘀胶囊中色谱峰的鉴别过程。TIC图中的保留时间为8.751 min(图2B)的色谱峰显示的准分子离子为295.136 2，利用 Qualiative Analysis 软件分析工具计算精确质量数的可能的元素组成(<5 ppm)，结合数据库中已知化合物的质荷比，初步确定分子式为 C19H18O3。通过计算该准分子离子的核素分布情况，从图3A可以看出同位素分布的理论值与实际值恰好吻合，确定此峰为丹参酮ⅡA。同理可得该模式下2号峰二氢丹参酮Ⅰ的解析过程，如图3B。

2.5 扶正化瘀胶囊中化学成分的鉴别结果

根据飞行时间质谱测得的精确的相对分子质量，比对所建的扶正化瘀胶囊化学成分数据库，应用 Qualiative Analysis质谱分析软件计算分子组成，将理论值与实测值进行比对，结合上述对照品鉴别结果及相关文献报道[9,11,15]，对扶正化瘀胶囊在正/负离子模式下所得色谱图中色谱峰分析，在正离子模式下初步鉴别 出 115个化学成分，结果见表1。在负离子模式下初步鉴别出66个化学成分，结果见表2。其中，正、负离子模式下均有响应的有 28个(表中标#)。对于部分为未区分的同分异构体，后期可考虑调节碎片电压得到化合物的裂解规律进而区分。对于化学成分的药材归属，由表1和表2可见，对于峰容量较大和响应强度较高的化学成分主要集中于君药丹参，臣药冬虫夏草和桃仁，符合中药复方配伍原则。

图2 扶正化瘀胶囊供试品、对照品溶液的总离子流图和提取离子流图 A.对照品混合溶液正离子模式下总离子流图；B.扶正化瘀胶囊供试品溶液对丹参酮ⅡA提取离子流图；C.对照品混合溶液对丹参酮ⅡA提取离子流图；D.扶正化瘀胶囊供试品溶液对二氢丹参酮Ⅰ提取离子流图；E.对照品混合溶液对二氢丹参酮Ⅰ提取离子流图1.丹酚酸B；2.二氢丹参酮Ⅰ；3.丹酚酸A；4.丹参酮ⅡA；5.苦杏仁苷；6.虫草素；7.五味子醇甲；8.五味子乙素；9.五味子酯甲；10.山柰酚

图3 正离子模式下化合物准确相对分子质量及同位素分布图 A.丹参酮ⅡA；B.二氢丹参酮Ⅰ

编号保留时间(t/min)化合物名称化学式M+X理论分子量(m/z)实际分子量(m/z)误差(/10-6)归属药材C11.118ferulicacidC10H10O4(M+H)+195.0665195.0658-1SalviamiltiorrhizaBge.C21.693ziganeinC15H10O4(M+H)+255.0667255.0650.42SalviamiltiorrhizaBge.C36.615dihydrokaranoneC15H22O(M+H)+219.174219.17420.28SalviamiltiorrhizaBge.C43.229dihydronortanshinoneC17H14O4(M+H)+283.0968283.0972-2.31SalviamiltiorrhizaBge.C56.713danshenspiroketallactoneC17H16O3(M+H)+269.1172269.1173-1.74SalviamiltiorrhizaBge.C67.264isotanshinoneIC18H12O3(M+H)+277.0861277.0866-2.26SalviamiltiorrhizaBge.C73.139monodydroxytanshinoneIC18H12O4(M+H)+293.0811293.08051.3SalviamiltiorrhizaBge.C81.266salvianolicacidG#C18H12O7(M+H)+341.0657341.06530.05SalviamiltiorrhizaBge.C97.847dihydrodanshinoneI∗C18H14O3(M+H)+279.102279.1018-0.04SalviamiltiorrhizaBge.C105.5223-hydroxymethylenetanshin-quinoneC18H14O4(M+H)+295.0969295.0962-1.31SalviamiltiorrhizaBge.C117.617miltironeIC18H16O2(M+H)+265.1223265.12171.78SalviamiltiorrhizaBge.C126.1381,2,15,16-tetrahydrotanshi-noneIC18H16O3(M+H)+281.1172281.11670.99SalviamiltiorrhizaBge.C134.84(+-)-danshexinkunAC18H16O4(M+H)+297.1124297.1122-1.94SalviamiltiorrhizaBge.C142.35kaempferol∗#C18H16O5(M+H)+313.1083313.10681.36SalviamiltiorrhizaBge.C155.3174-methylenemiltironeC18H18O2(M+H)+267.1383267.1382-0.16SalviamiltiorrhizaBge.C161.2ttanshindiolBC18H18O5(M+H)+315.1206315.1221-0.53SalviamiltiorrhizaBge.C179.138salvinoneC18H20O2(M+H)+269.1539269.1537-2.67SalviamiltiorrhizaBge.

(续表1)

(续表1)

(续表1)

注：*已通过对照品鉴别；#均经正、负离子模式下鉴别

表2 扶正化瘀胶囊中化学成分的负离子模式鉴别

(续表2)

(续表2)

注：*已通过对照品鉴别；#均经正、负离子模式下鉴别

3 结论

本研究首次运用UHPLC-QTOF/MS技术快速初步鉴别出扶正化瘀胶囊154个化学成分，利用已有的标准品已成功鉴别10个成分，表征了扶正化瘀胶囊的化学物质基础，为其进一步的质量标准制订及体内外药理研究提供了前提条件，为扶正化瘀胶囊的深入研究奠定良好基础。