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细茎石斛花朵挥发性成分分析

2019-09-10仇硕郑文俊夏科唐凤鸾赵健丁莉赵志国

广西植物 2019年11期
关键词:气相色谱花朵

仇硕 郑文俊 夏科 唐凤鸾 赵健 丁莉 赵志国

摘 要:為了探究细茎石斛花朵释放的挥发性成分特点,该研究利用固相微萃取(SPME)法结合 GC-MS 技术,检测了花色为黄绿的细茎石斛花朵不同花期、不同部位的挥发性成分和相对含量,还比较了黄绿色、白色和白色带淡紫色等三种花色的挥发性成分。结果表明:花色黄绿的细茎石斛花朵挥发性化合物成分总计为59种,其中盛花期最复杂(含有41种),这些成分归属于烯类、芳香族化合物、含氮化合物、酯类、醇类和醛酮类。在不同花期检测到的挥发性成分中, (1R)-(+)-α蒎烯相对含量始终最高,保持在27%以上;始花期和盛花期释放且相对含量较高的成分有顺-芳樟醇氧化物、β-水芹烯、柠檬烯、罗勒烯、(1S-cis)-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)-1,2,3,5,6,8α-六氢萘和乙酸芳樟酯,相对含量均高于5%;衣兰烯于花蕾期相对含量最高,衰落期消失。这8种化合物可能是细茎石斛花香释放的主要香气成分或特征成分。在花色黄绿的细茎石斛盛开期的两个开花部位中,花瓣的挥发性成分有27种,蕊柱17 种,其中烯类物质分别占74.16% 和79.06%,花瓣可能是细茎石斛主要的释香部位。三个花色的细茎石斛盛花期挥发性化合物均在40种左右,既有成分的差异又有含量的差别,其中有25种为共同含有,三个花色均是(1R)-(+)-α蒎烯相对含量最高,含量在27%左右。这表明烯类物质是影响细茎石斛花香的重要化合物,不仅对细茎石斛产品开发提供了参考,而且还为其花香基因工程育种奠定了基础。

关键词:铜皮石斛, 花朵, 香气成分, 气相色谱/质谱联用法

中图分类号:Q946

文献标识码:A

文章编号:1000-3142(2019)11-1482-14

Abstract:In order to understand the volatiles in flowers of Dendrobium moniliforme, the constituents and relative contents in different florescences and flower parts of the yellow-green flower color of D. moniliforme were determined by solid phase microextraction (SPME) and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS), and the volatile components of three kinds colors of D. moniliforme were also compared by analyzing the constituents and relative contents determined in flowering stage. The results showed that there were 59 volatile compounds identified at four flowering stages of the yellow-green flower color of D. moniliforme, and the flowering stage was the most complicated stage because there were 41 volatile compounds. These compounds belongs to alkenes, aromatic, nitrogenous compound, esters, alcohols, alkanes, aldehydes and ketones. The relative contents of 1R-α-pinene was more than 27%, which was the highest among all compounds at four flowering stages; During the first flowering stage and flowering stage, there were another six compounds including cis-linaloloxide, β-phellandrene, limonene, 3,7-dimethytl-1,3,7-octatriene, (1S-cis)-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-naphthalene, 1,2,3,5,6,8α-hexahydro and 3,7-dimethyl-1,6-octadien-3-ol-acetate, and their relative contents was the highest; The relative contents of ylangene was more than 5% during bud stage, and disappeared during declining stage. Thus, the eight compounds were the major volatile components or the characteristic constituents for D. moniliforme. There were 27 components identified in petals and 17 in gynandrium. In petals and gynandrium, the relative content of alkenes compounds was the highest, 74.16% and 79.06%, respectively. And the petals were probably the most important part that could influence the volatile releasing. There were about 40 components identified in the flowering stage of three colors of D. moniliforme, differently. And there were 25 common constituents existed in three colors of D. moniliforme. Alkenes was the most important compounds for D. moniliforme. This plays an important role for aromatic cultivar breeding and essential product development of D. moniliforme.

Key words:Dendrobium moniliforme, flower, volatile component, GC-MS

细茎石斛(Dendrobium moniliforme)為兰科石斛属多年生草本植物,又名铜皮石斛,分布于中国大陆和台湾地区以及印度、日本和韩国等地(中国植物志编辑委员会,1980)。细茎石斛具有茎细、花小、药效高等特征,是中药石斛中重要的代表种类之一,其成品药材常被称为“铜皮枫斗”。细茎石斛含有较高的多糖、生物碱及微量元素等(陈云龙等,2001;胡国海等,2010;Muhammad,2018),具有滋阴生津、润肺明目、抗癌防老等功效(黄晓洁,2014; 国家药典委员会,2015),民间常用于治疗消化不良、痈疮肿毒及风湿疼痛等疾病(Jiangsu New Medical College,1986)。此外,细茎石斛开花清香宜人,是培育芳香型兰花品种的重要亲本材料,具有较高的观赏价值。

据近年来的报道,细茎石斛的花可制成花茶,且具有茶香协调、芬芳持久的特点。鉴于此,细茎石斛开花时释放的香气物质因而备受关注。张倩倩等(2011)利用水蒸气蒸馏法并结合GC-MS法提取细茎石斛粉碎的干燥花中的挥发油,发现挥发油成分主要包括烯、醛、酯和醇类等。张聪等(2017)采用正己烷回流法并结合GC-MS法对细茎石斛鲜花挥发油进行提取和分析鉴定,发现烷烃、烯烃、醇、酮、酸、酯、酚等是其主要的化学成分。据报道,溶剂萃取的成分不一定能真实反映花朵释放的香气成分,而利用固相微萃取(SPME)结合GC-MS 技术检测鲜花的香气成分则能准确测定花香成分,如对麝香石斛、鼓槌石斛、罗河石斛、细叶石斛、密花石斛以及秋石斛杂交种花朵的挥发性成分的报道(Julsrigival et al., 2013; 张莹等, 2011;李崇晖等,2015;丁灵等,2016)。

细茎石斛是多型性的广布种,植株的大小,花的颜色常因地区不同而有变化,花色包括黄绿色、白色或白色带淡紫红色等三种,有时芳香(中国植物志编辑委员会,1999)。有关三个花色之间是否有香味差别还不清楚,同一花色不同开花时期的释香成分尚未见有报道。因此,本研究采用顶空固相微萃取(HS-SPME)并结合气相色谱/质谱联用(GC-MS)技术,以开花黄绿色的细茎石斛为代表,测定不同开花时期、不同花器官的香气释放成分,同时检测和分析三个花色细茎石斛香气成分的差异。旨在为其鲜花加工产业提供科学的指导,同时为后续的花香代谢研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料 所用的样品为细茎石斛(Dendrobium moniliforme),引种于云南文山,种植于广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所兰花苗圃中。本研究以花色黄绿的细茎石斛为材料,首先测定花蕾期、始花期、盛开期和衰落期等四个阶段的香气释放成分(图1);然后测定和分析蕊柱和花瓣两个部位的香气释放成分;最后测定和分析黄绿色、白色和白色带淡紫红色等三种颜色的细茎石斛盛开期的香气释放成分差别。

1.1.2 仪器 手动固相微萃取进样器(美国SUPELCO公司),50/30 μm PDMS /CAR/DVB萃取头(美国SUPELCO公司),6890N-5975B气相色谱-质谱仪GC-MS (美国Agilent 公司),40 mL棕色顶空取样瓶、水浴锅(上海精学科学仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 花香成分的GC-MS 分析 同种环境条件下选择生长和开花正常的15株(丛)苗作为采集对象,将晴天9:00—11:00采集的样品置于棕色顶空取样瓶中,重复3次。先将萃取头插入GC-MS进样口,250 ℃老化30 min。采集10朵鲜花朵置于40 mL棕色顶空取样瓶中,插入50 μm/30 μm PDMS /CAR /DVB纤维头,于40 ℃下顶空萃取 30 min。萃取完成后,取出纤维头,插入GC-MS进样口,解析5 min 后,进样分析。

色谱条件:HP-5MS石英毛细管色谱柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm);流速为0.8 mL·min-1;载气为高纯度氦气(99.999%),不分流模式。程序升温:起始柱温为40 ℃保持3 min,以3 ℃·min-1的速率升温到73 ℃,维持3 min,以5 ℃·min-1升温至220 ℃,保持2 min。

质谱条件:进样口温度维持在230 ℃,离子源温度为150 ℃,电离方式为EI,电子能量70 eV,GC-MS传输线温度为250 ℃,扫描范围为40~450 amu(Cai et al., 2014)。

1.2.2 挥发性花香成分鉴定分析 根据GC-MS总离子流色谱图,解析各个峰所对应的质谱图,将所得到的质谱数据,用Xcalibur1.2版本软件,与NIST98所提供的标准物质谱图库进行比对,同时根据在相同升温程序下用正构烷烃标准样品(C8~C40)计算得到科瓦茨保留指数(Kovats Retention Indices,RI)和NIST网站上对应物质所列举的相关参考文献进行进一步定性确认;根据离子流峰面积归一化法计算各组分在总挥发物中的相对含量。

2 结果与分析

2.1 细茎石斛(黄绿色花)不同花期挥发性香气成分的比较

经GC/MS 分析,花色黄绿的细茎石斛不同花期检测到的挥发性化合物成分数量不同,花蕾期13 种,始花期21种,盛花期41种,衰落期11种,但同一成分可能在不同花期均检测到,如始花期和盛花期均含有L-氨基丙醇,而在4个花期中则均含有(1R)-(+)-α蒎烯等,经最终统计,在整个花朵开放过程中挥发性化合物成分总计为59种。由此可见,随着花朵的开放,细茎石斛的挥发性成分的组成逐渐复杂,盛花期的成分最多,而衰落期又减少。香气组分中相对含量较高的化合物名称、出峰时间及相对含量见表1。由表1可知,在细茎石斛不同花期检测到的化合物相对含量较高的有 (1R)-(+)-α蒎烯、β-水芹烯、柠檬烯、顺-芳樟醇氧化物、罗勒烯、乙酸芳樟酯、(1S-cis)-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)-1,2,3,5,6,8α-六氢萘、衣兰烯、2-苯并 [1,3]二恶英-5-基-8-甲氧基异黄酮-3-硝基-2H-苯并吡喃、3,6-二甲氧基-9-(2-苯甲基乙二酯)-9-芴醇、四甲基-磷氰酰亚胺、己二酸二辛酯和8-庚基十五烷等13种化合物,相对含量均超过5%。

由花蕾期至衰落期,随着花朵的开放和凋谢,(1R)-(+)-α蒎烯相对含量始终最高,保持在27%以上;顺-芳樟醇氧化物于花蕾期至盛花期含量均保持较高,在10%以上,于衰败期消失;衣兰烯相对含量逐渐减少,在衰落期消失;β-水芹烯于始花期出现,并于盛花期含量达到5.89%;柠檬烯于始花期和盛花期出现,含量均达到5%;罗勒烯和(1S-cis)-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)-1,2,3,5,6,8α-六氢萘于始花期出现,含量分别为10.83%和6.86%,但盛花期均减少,分别为2.85%和3.47%;乙酸芳樟酯仅在盛花期释放,且含量达到7.44%。这8种化合物的含量在细茎石斛四个开花时期的总含量分别达到60.28%、74.23%、65.15%和55.81%[(1R)-(+)-α蒎烯]。这说明这几种化合物可能是细茎石斛花香释放的主要挥发性成分。此外, 2-苯并 [1,3]二恶英-5-基-8-甲氧基异黄酮-3-硝基-2H-苯并吡喃仅在花雷期释放,3,6-二甲氧基-9-(2-苯甲基乙二酯)-9-芴醇、四甲基-磷氰酰亚胺、己二酸二辛酯和8-庚基十五烷仅在衰落期释放,这五类化合物对细茎石斛的香气释放可能没有贡献,不是主要香气成分。

将细茎石斛的挥发性成分划分为烯类、芳香族化合物、含氮化合物、酯类、醇类和醛酮类等6 类,4 个花期6 类化合物的组分及相对含量变化如表2 所示。由表2 可知,花期不同,各类化合物的相对含量变化明显。从花蕾期至衰落期均是烯类物质相对含量最高,分别达到67.81%(5种)、90.23%(14种)、70.88%(14种)和56.35%(3种),其中均以(1R)-(+)-α蒎烯含量最高;花蕾期含量相对较高的还有芳香族化合物,达到22.19%;始花期其他化合物含量均相对较低;盛花期除含有较多的烯类外,含氮化合物、酯类、醇类、醛同类均高于5%,芳香族化合物3.71%;衰落期醇类18.85%、醛酮类8.95%、酯类8.02%、含氮化合物6.28,而芳香族化合物仅为0.57%。

2.2 黄绿色花的细茎石斛花朵不同部位挥发性成分的比较

经GC/MS 分析, 测得花色黄绿的细茎石斛盛花期花瓣含挥发性化合物27种,蕊柱17 种。由此可见,花瓣的香气组成更为复杂。两个部位香气组分中相对含量较高的化合物名称、出峰时间及其相对含量见表3。由表3 可知,两个部位含有9种共同的化合物,其中多数含量差异较大。构成花瓣的主要香气成分有(1R)-(+)-α蒎烯(33.69%)、β-水芹烯(6.18%)、柠檬烯(5.58%)、顺-芳樟醇氧化物(13.86%)、乙酸芳樟酯(9.54%),其相对总含量达到68.85%;蕊柱中的主要香气成分有(1R)-(+)-α蒎烯(64.32%)、α-柏木烯(5.90%),相对含量总和达到70.22%。花瓣及蕊柱中其余化合物含量较低。

表4结果显示了同类化合物在不同花朵部位中的组分及其相对含量。花瓣中相对含量最高的是烯类化合物,含有11种,相对总含量达到74.16%;其次是酯类化合物,占9.99%。蕊柱中烯类化合物组分仅有5种,但相对总含量却最高,占79.06%;其次是含氮化合物和醛酮类,分别占9.14%和7.16%;蕊柱中不含酯类和醇类化合物。

2.3 不同花色品种挥发性成分的比较

表5结果显示了三个花色细茎石斛盛花期的挥发性化合物的名称、出峰时间及其相对含量。由表5可知,黄绿色的细茎石斛共检测出41种化合物,白色的细茎石斛38种,白色带淡紫色的细茎石斛35种。其中有25种化合物是三个花色的细茎石斛共同含有的,但相对含量不完全一致。构成黄绿色细茎石斛的主要挥发性成分有 (1R)-(+)-α蒎烯(27.61%)、β-水芹烯(5.87%)、柠檬烯(5.13%)、顺-芳樟醇氧化物(10.32%)及乙酸芳樟酯(7.99%),其相对总含量达到56.92%;而白色细茎石斛的主要挥发性成分为(1R)-(+)-α蒎烯(28.85%)、顺-芳樟醇氧化物(11.73%)及乙酸芳樟酯(10.23%),其相对总含量达到50.81%;白色带淡紫色的细茎石斛的主要挥发性成分有(1R)-(+)-α蒎烯(27.61%)、顺-芳樟醇氧化物(10.97%)、乙酸芳樟酯(8.63%)、月桂烯(5.06%)、1-亚甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烷(5.43%)、柠檬烯(6.89%),其相对总含量达到64.59%。

由表2和表6还可看到,同类化合物在3个花色细茎石斛盛花期的组分及其相对含量也不完全一致。黄绿色细茎石斛相对含量最高的是烯类化合物,达到70.88%,组分有14种;含氮化合物等其他类化合物含量在3.71%~7.76%;白色细茎石斛和白色带淡紫色的细茎石斛含量最高的也都是烯类化合物,相对含量分别达到65.21%和71.11%,组分分别有12种和14种;白色细茎石斛含量较多的依次还有酯类11.49%、醛酮类8.67%、醇类5.51%、含氮化合物4.9%和芳香族化合物3.75%;而白色带淡紫色的细茎石斛含量较多的还有酯类、醇类和醛酮类,含量分别达到8.63%、5.99%和5.30%。

3 讨论与结论

3.1 细茎石斛的主要挥发性物质成分

张倩倩等(2011)利用水蒸气蒸馏法提取细茎石斛干花挥发油,结合GC-MS检测,鉴定出29个化合物,包括烯类、醛类、酯类和醇类等成分,其中相对含量大于5.0%的有2,4,4三甲基-二戊烯(11.17%)、5,5-二甲基-2-己烯(11.12%)、β-石竹烯(6.47%)、异土木香内酯(5.95%) 和1,3,3 二甲基丁烯-1,1-二苯基(5.20%)等;张聪等(2017)采用正己烷回流法提取細茎石斛鲜花挥发性成分,并用GC-MS分析鉴定,分离出91个色谱峰,鉴定出72个化合物,主要包括烷烃、烯烃、醇、酮、酸、酯、酚等,其中相对含量较高的有二十一烷(38.957%)、二十三烷(13.558%)、二十二烷(5.245%)。本研究利用固相微萃取(SPME)法提取细茎石斛鲜花挥发性成分,经用GC-MS 技术检测,发现细茎石斛不同花期、不同部位以及不同花色虽有一定成分及含量的差异,但总的挥发性成分有59种,这些成分归属于烯类、芳香族化合物、含氮化合物、酯类、醇类和醛酮类等。其中,含量高于5%的有(1R)-(+)-α蒎烯、顺-芳樟醇氧化物、衣兰烯、β-水芹烯、柠檬烯、罗勒烯、(1S-cis)-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)-1,2,3,5,6,8α-六氢萘及乙酸芳樟酯等。这说明水蒸气蒸馏法提取的成份相对较少,也可能与提取的干花有关。正己烷回流法提取的成分最多。但是,本研究采用的SPME提取技术不需要有机试剂提取,具有处理快捷简便、材料用量少以及易于与气相等技术联用的特点。

石斛属植物种类丰富,已报道有些种类具有花香、果香或草本香气等(Julsrigival et al., 2013;李崇晖等,2015)。张莹等(2011)报道4个秋石斛品种的主要香气成分为烯烃类、醇类和醛类;丁灵等(2016)也报道5个秋石斛品种的香气成分主要是萜烯类以及少量芳香族化合物和酯类;李崇晖(2015)报道野生种鼓槌石斛和细叶石斛花香成分以烯类化合物为主,但罗河石斛和密花石斛则以酯类和烷类为主。本研究结合GC-MS的分析结果,花色为黄绿色的细茎石斛四个花期检测到的挥发性成分中,含量较高的均是烯类化合物,盛花期高达90.23%。两个花器官烯类化合物占74.16%和79.06%。花色为白色和白色带淡紫色的盛花期挥发性成分检测分析表明,烯类化合物分别占65.21%和71.11%。从挥发性成分组分分类看,不同开花时期、不同开花部位以及不同花色的细茎石斛,烯类化合物成分最多,含有芳香族化合物、含氮化合物、酯类、醇类及酚醛类。此外,张倩倩等(2011)的鉴定结果认为烯类化合物是最多的,而张聪等(2017)报道则认为烷烃相对含量最高,还包含烯烃、醇、酮、酸、酯、酚等。

3.2 细茎石斛花香释放的主要香气成分

植物花香程度与花朵的发育程度有关。一般始花期和盛开期花香释放量较高,花香成分含萜烯类较高的植物也是半开期和盛花期释放量较高(冯立国等,2008;张辉秀等,2013)。本研究结果与这一观点一致,花黄色的细茎石斛于始花期和盛花期花香释放种类丰富。随着花朵的开放和凋谢,主要挥发性成分(1R)-(+)-α蒎烯是典型的单萜类物质,相对含量始终最高,保持在27%以上,但其嗅感阈值较低,具松木香味,推测此化合物为细茎石斛的基本花香成分之一。顺-芳樟醇氧化物于始花期和盛花期含量都保持较高,均在10%以上,于衰落期消失;β-水芹烯于始花期出现,盛花期含量达到5.89%;柠檬烯于始花期和盛花期出现,含量分别为6.13%和5.13%;罗勒烯和(1S-cis)-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)-1,2,3,5,6,8α-六氢萘于始花期出现,含量分别为10.83%和6.86%,但盛花期均减少,分别为2.85%和3.47%;而乙酸芳樟酯则仅在盛花期释放,且含量仅为7.44%。以上说明这8种化合物可能是细茎石斛花香释放的主要香气成分或特征成分。这些主要香气成分中,乙酸芳樟酯属于酯类,(1S-cis)-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)-1,2,3,5,6,8α-六氢萘是芳香族类,其余成分均属于烯类化合物,其中衣兰烯是倍半萜类,其余都是单萜及其衍生物。王小婧(2008)研究表明,蒎烯类物质可以杀菌抗菌、抗癌、利胆消炎、医疮止痒,并对人体呼吸系统、心血管系统、中枢神经系统等有保健作用;顺-芳樟醇氧化物是桂花的主要香气物质,可以提取香精(Cai et al., 2014;夏科等,2018);乙酸芳樟酯是制備高级香精不可缺少的香料,也是我国规定暂时允许使用的食用香料(张蕊,2014)。这些细茎石斛主要香气成分的检测为其精油的开发提供了支撑。

3.3 细茎石斛的主要释香部位及不同花色之间的挥发性成分差异

本研究检测结果表明,不同部位的挥发性组分存在一定差异,且相同成分在不同部位中的相对含量也不完全相同,这与苑兆和等(2008)对石榴以及张莹等(2011)对文心兰不同开花部位香气物质的研究结果类似。本研究花色黄绿的细茎石斛的花瓣比蕊柱含有的挥发性化合物多10种,主要构成成分有(1R)-(+)-α蒎烯、β-水芹烯、柠檬烯、顺-芳樟醇氧化物和乙酸芳樟酯等5种,而蕊柱主要含有(1R)-(+)-α蒎烯和α-柏木烯。因此,花瓣可能是细茎石斛主要的释香部位。

本研究检测到三个花色的细茎石斛挥发性化合物均在40种左右,其中有25种为共同含有。在三种花色的主要挥发性成分中(盛花期为例),(1R)-(+)-α蒎烯、顺-芳樟醇氧化物和乙酸芳樟酯是共同含有的主要释香成分,花色为黄绿色的还含有β-水芹烯和柠檬烯等2种主要成分,而花白色带淡紫色的细茎石斛还含有月桂烯、伪柠檬烯和柠檬烯等3种主要成分。因此,三个花色的细茎石斛既有相同的挥发性成分,又有不同的挥发性成分。

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