吴 波，谢 晶*

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台，食品科学与工程国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306）

石斑鱼（Epinephelus）隶属于鮨科（Serranidae），为暖水性鱼类，主要养殖于我国海南、广东、福建及浙江沿海地区，且养殖量占中国总养殖量95%，占世界石斑鱼总养殖量的80%以上，并呈增长趋势，供给国内外消费者[1-4]。石斑鱼因其蛋白质含量高、脂肪含量低，且肉质细嫩、口感佳，而深得消费者青睐，具有较高的市场价值和消费需求，市场流通率高，因此石斑鱼活体运输技术尤为重要[5-6]。

为保证石斑鱼活体运输到达更多更远的地方，多选择有水活运，期间鲜活石斑鱼常常会因为水体温度、盐度、氨氮、溶解氧含量等因素的变化而发生运输应激，无论是轻度应激还是重度应激均会对鱼体免疫功能、抗氧化功能、存活率产生不同程度的影响[7-8]。

在鲜活鱼体有水活运过程中，温度和盐度作为基础环境因子，亦是诱发运输应激的主要应激源。过高或过低的温度、盐度会引发鱼体应激反应，使鱼体内环境失衡，影响其免疫功能。一般通过测定鱼体血清中皮质醇、血糖含量变化来评价鱼体发生应激反应的程度，进而评价鱼类生理机体健康状况[9-14]。除此以外，热休克蛋白（heat shock proteins 70，HSP70）也是反映鱼体受到应激反应程度的重要指标，从基因分子水平角度出发，当鱼体受到应激源刺激时，HSP70的转录表达水平会发生改变，从而修复和降解改变或变性的蛋白，起到指示应激反应的作用[15-16]。

目前，国内外学者大多从免疫功能、抗氧化功能评价等角度研究了不同鲜活鱼类有水运输的最佳温度、盐度。范秀萍等[17]研究了温度对石斑鱼有水活运过程中代谢和鱼肉品质的影响；王利娟等[18]研究了水温对加州鲈鱼保活运输的影响；王雯等[19]研究了不同盐度对斜带石斑鱼幼鱼血清离子浓度和激素水平的影响。已有文献大多是从温度或是盐度等单一影响因素进行保活工艺的研究，较少考虑温度、盐度对鱼类有水活运的交互影响。本实验以石斑鱼为材料，采用响应面法研究温度和盐度的变化以及两者之间的交互作用对石斑鱼血清、肝中的皮质醇、血糖和HSP70的影响，优化石斑鱼有水活运工艺，以获得最佳的运输水温、盐度条件。

1 材料与方法

1.1 材料

石斑鱼（品种为珍珠龙胆石斑鱼，俗称老虎斑）购自上海市浦东新区芦潮港，选取同一批体质健康无伤病，平均体长为（27.50±1.55）cm，平均体质量为（500±120）g，加水充氧运输至实验室。石斑鱼购回后将其停食暂养于实验室水族箱48 h，暂养和运输密度均为2 kg/m3，水温为27 ℃，盐度为，空气泵充氧，充氧速率为22 L/min，保证水中溶解氧含量不小于6 mg/L，pH 7.0，暂养期间每日50%换水。

1.2 仪器与设备

LX-100VTR模拟运输振动台 上海鲁轩仪器设备厂；BS-200全自动生化分析仪 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；SH-1000Lab-全波长酶标仪 北京宏昌信科技有限公司；LP-20水族箱三合一曝气机 深圳市兴日生实业有限公司；F2640型多点温度采集仪 美国Fluke公司；5810R高速冷冻离心机 上海艾测电子科技有限公司；HS 28A全自动循环水冷机 广东海利集团。

1.3 方法

1.3.1 不同温度下有水活运过程中石斑鱼运输应激的测定

将停食暂养后的石斑鱼分为10、15、21、27 ℃和30 ℃共5 组，每组用鱼20 条，分别置于5 个不同的120 L水族箱，以2 ℃/h降温速率进行降温直至相应温度，实验开始后将水族箱放置模拟振动台上弱振，振动台转速为150 r/min，相当于陆路运输中速率为20 km/h，并在运输0、3、10、17、24、48 h观察其存活率并取样，取样时采用一次性无菌注射器尾动脉抽血，静置30 min，4 ℃、6 000 r/min离心15 min取其血清，放入－80 ℃冰箱保存；在无菌操作台内用已消毒的剪刀和镊子取其肝脏组织后放入－80 ℃冰箱保存，并尽快实验防止RNA降解。

1.3.2 不同盐度下有水活运过程中石斑鱼运输应激的测定

1.3.3 皮质醇质量浓度的测定

采用南京建成生物工程研究所的鱼皮质醇ELISA试剂盒。

1.3.4 血糖浓度的测定

采用葡萄糖氧化酶法测定，以葡萄糖计。

1.3.5 HSP70相对表达量的测定

采用上海捷瑞动物总RNA快速提取试剂盒、TaKaRa反转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）试剂盒并进行荧光定量聚合酶链式反应，具体方法参考文献[20]。

1.3.6 响应面试验

通过以上实验筛选出适宜石斑鱼有水活运的温度、盐度范围。采用二次通用旋转组合设计，在用Design-Expert随机编组时采用中心组合响应面法，研究温度和盐度对石斑鱼运输应激的联合效应，其中，将血糖、皮质醇含量作为响应指标，试验温度范围为15～27 ℃，盐度范围为10～30，将每个试验因子进行水平编码分别为－α、－1、0、1、α（|α|=1.414）。试验采用2因素5水平，由系统将温度和盐度随机交叉组合形成13 组试验，其中，中心点重复5 次，试验平行测定3 次，每组试验样本数量为10 尾，运输水温度、盐度根据软件设计进行设定，其余暂养及运输水条件参考1.1节，运输方式及取样方式参考1.3.1节，在运输24 h时取其血清用以血糖、皮质醇的测定。

1.4 数据处理

采用Origin Pro 2016、SPSS 21.0、Design-Expert 8.06等软件进行数据分析处理。其中，响应面试验数据结果以 ±s表示。通过Design-Expert 8.06软件建立二次回归方程模型为：

式中：Y为响应变量（皮质醇、血糖）；T为温度；S为盐度；b0为回归常数；b1、b2分别为温度、盐度一次效应系数；b3为温度、盐度互作效应系数；b4、b5为温度、盐度二次效应系数。

2 结果与分析

2.1 温度对运输过程中石斑鱼运输应激及存活率的影响

2.1.1 温度对运输过程中石斑鱼存活率的影响

表1 石斑鱼在不同温度与保活时间下的存活率Table 1 Survival rates of grouper at different temperatures and transportation times

温度是石斑鱼有水活运工艺的关键环境因子，严格控制运输水温度是有水保活工艺研究的基础，外界温度的波动会直接影响鱼体生理变化，影响鱼体的代谢速率，从而损伤机体，严重时会导致鱼体死亡，直接影响其存活率。如表1所示，运输温度为10 ℃时，石斑鱼有水活运开始后出现死亡，运输时长仅为3 h，过低的温度无法使鱼体进入正常休眠状态，属于不可接受温度范围，造成机体不可逆损伤直至死亡；运输温度为30 ℃时，石斑鱼有水活运48 h时存活率仅为50%，且运输72 h时全部死亡，过高的温度使鱼体处于生命活动旺盛期，促进代谢的同时会增加水体氨氮含量不适宜鱼体长时间存活，且旺盛的生命活动伴以模拟运输会给鱼体带来剧烈机体碰撞导致严重的机械损伤，因此，10 ℃和30 ℃均不适用作为石斑鱼有水活运水温；运输温度为15、21 ℃和27 ℃时，石斑鱼有水活运至少可维持72 h，且在运输48 h后存活率均高达95%以上，适宜作为石斑鱼有水活运工艺研究的水温范围；综上，石斑鱼有水活运工艺研究的温度范围选择15～27 ℃。宋志明[21]研究了温度对暖水性鱼类点篮子鱼幼鱼生长和代谢的影响，表明温度在19～31 ℃范围内，其存活率均达到95%以上，与本研究结论相近。

2.1.2 温度对运输过程中石斑鱼血清皮质醇含量的影响

图1 温度对有水活运过程中石斑鱼血清皮质醇含量的影响Fig. 1 Effect of water temperatures on serum cortisol concentration of grouper during water transportation

皮质醇是反映鱼体应激的指示性指标，当鱼体发生应激反应时，会引起各项激素水平变化，而皮质醇则是反应链中分泌的最后一种激素，随着应激强度的增大，皮质醇含量也会不同程度上升[22]。如图1所示，15、21、27 ℃和30 ℃组石斑鱼血清皮质醇含量均呈先上升后下降的趋势，并在运输3 h时达到最大，且在该点30 ℃组石斑鱼血清皮质醇含量显著高于其余3 组（P＜0.05），说明高温使石斑鱼产生了剧烈的应激反应，分泌大量皮质醇，不适宜作为石斑鱼有水活运工艺的温度范围，在运输刚开始时，鱼体无法及时适应运输振动带来的刺激，均产生了不同程度的应激反应导致皮质醇含量上升；15 ℃组石斑鱼血清皮质醇含量显著低于其余3 组（P＜0.05），低温使石斑鱼处于半休眠状态，其新陈代谢活动、分泌激素能力均比其余组石斑鱼弱；21 ℃组与27 ℃组介于其余2 组之间，总体而言，随着温度降低，皮质醇含量呈下降的趋势，由此，石斑鱼有水活运较适宜的温度范围为15～27 ℃。邵彦翔等[23]以杂交石斑鱼为实验对象，研究高温突变对其血清指标产生的影响，研究结果同样显示高温胁迫下的杂交石斑鱼与对照组相比皮质醇含量显著升高。

2.1.3 温度对运输过程中石斑鱼血糖浓度的影响

应激反应发生，生命活动剧烈、新陈代谢旺盛会使鱼体血糖浓度上升，当应激反应持续时间延长，鱼体不断消耗能量，则鱼体内的血糖被不断分解用以能量的供给[24-25]，因而血糖浓度亦是鱼类应激反应的指示性指标。如图2所示，4 组不同温度运输组鱼体内血糖浓度均呈先上升后下降的趋势，并在运输10 h时血糖浓度达到最大，在该点15 ℃组鱼体血糖浓度显著低于其余3 组（P＜0.05），而30 ℃组鱼体血糖浓度显著高于其余3 组（P＜0.05），说明应激反应剧烈不适宜运输，在活鱼运输初期因鱼体需适应模拟运输振动产生不同程度的应激反应，因15 ℃组的鱼体为休眠状态，其生命活动远少于其余组，则应激反应较弱，相反，30 ℃组鱼体生命活动过多导致应激反应剧烈。总体而言，鱼体血糖浓度变化速率随温度降低而减缓，差异显著（P＜0.05），说明应激反应程度随着温度降低而得到缓解，因此，石斑鱼有水活运较适宜的温度范围为15～27 ℃。Pilinkovskij等[26]研究运输胁迫对大西洋鲟血清指标产生的影响，研究结果显示运输胁迫会使鱼体内血糖水平显著升高且与对照组差异显著。

2.1.4 温度对运输过程中石斑鱼HSP70表达量的影响

图3 温度对有水活运过程中石斑鱼HSP70表达量的影响Fig. 3 Effect of water temperature on HSP70 mRNA expression of grouper during transportation

HSP70是应激时常被研究的指示性指标，它能促进新生多肽链的折叠，并促进变异或变性的蛋白质修复和降解。在鱼类中，当鱼体发生应激反应时会促进HSP70转录，HSP70水平的升高有助于保护细胞免受应激源刺激损伤，从而保护机体免受损伤，提高鱼体存活率[27]。如图3所示，4 组不同运输温度组石斑鱼肝脏HSP70转录水平随着运输时间的延长呈先上升后下降的趋势；30 ℃运输组，石斑鱼肝脏HSP70转录水平整体显著高于其余3 组，且17 h后HSP70转录水平逐渐恢复但并未恢复到初始水平，说明应激反应对肝脏造成了不可逆的损伤，因此不适宜用于石斑鱼有水活运工艺的温度；而15、21 ℃和27 ℃运输组HSP70转录水平均可逐步恢复至初始状态，说明肝脏损伤可修复。实验过程中因鱼体处于模拟运输状态，温度的差异、振动的影响均会使鱼体产生不同程度的应激反应，15 ℃组因其鱼体进入休眠状态而减少生命活动降低代谢速率，30 ℃组使鱼体处于超适宜生存温度，促进其代谢，不仅使运输水质进一步恶化，剧烈的应激反应往往会造成不可逆损伤。罗胜玉等[28]研究显示温度的突变会诱发鱼体发生应激反应，引发HSP70蛋白含量激增，随着胁迫时间延长，其含量可恢复至初始状态。

2.2 盐度对运输过程中石斑鱼运输应激及存活率的影响

2.2.1 盐度对运输过程中石斑鱼存活率的影响

表2 石斑鱼在不同盐度与保活时间下的存活率Table 2 Survival rates of grouper at different salinities and transportation times

2.2.2 盐度对运输过程中石斑鱼血清皮质醇含量的影响

如图4所示，4 组不同盐度运输水组的石斑鱼血清皮质醇含量均呈先上升后下降的趋势且在运输3 h时达到最高，且40组石斑鱼血清皮质醇整体水平显著高于其余3 组（P＜0.05），说明其应激反应强烈，该盐度水平不适于石斑鱼有水活运工艺，过高的盐度使鱼体生存过程中无法适应，机体内环境失衡，通过剧烈的应激反应进行自身调节，长时间抗应激反应造成不可逆损伤；3 个不同盐度组石斑鱼的血清皮质醇整体水平随盐度的增加而降低，说明高盐度组的鱼体应激水平显著低于低盐度组（P＜0.05），因此，石斑鱼有水活运适宜的运输水盐度范围为10～ 30。王雯等[19]研究了斜带石斑鱼幼鱼在不同盐度下血清离子浓度和激素水平的变化，结果显示5‰和10盐度组鱼体血清皮质醇水平显著高于20盐度组，与本实验结果一致。

图4 盐度对有水活运过程中石斑鱼血清皮质醇含量的影响Fig. 4 Effect of salinity on serum cortisol level of grouper during transportation

2.2.3 盐度对运输过程中石斑鱼血糖浓度的影响

图5 盐度对有水活运过程中石斑鱼血糖浓度的影响Fig. 5 Effect of salinity on blood glucose level of grouper during transportation

由图5可知，石斑鱼有水活运过程中鱼体血糖浓度均随运输时间的延长呈先上升后下降的趋势，40组鱼体血糖浓度整体显著高于其余3 组（P＜0.05），且变化速率快，不利于石斑鱼中长途运输；20组鱼体血糖浓度整体显著低于其余3 组（P＜0.05），且变化速率缓慢，变化不明显，说明低盐度组石斑鱼应激反应较弱，适宜中长途运输。10～30可作为石斑鱼有水活运工艺盐度范围。不同盐度水环境使鱼体产生不同程度应激反应，过高盐度使鱼体产生剧烈应激反应，在其抗应激过程中需大量血糖分解以供给能量，血糖浓度变化速率快，抗应激强度大。徐钢春等[13]研究了盐度对刀鲚运输应激指标的影响，结果显示运输应激导致鱼体血糖浓度上升，且加盐组鱼体血糖浓度随运输时间的延长趋于平稳，适宜的盐度可降低鱼体应激反应。

2.2.4 盐度对运输过程中石斑鱼HSP70表达量的影响

图6 盐度对有水活运过程中石斑鱼HSP70表达量的影响Fig. 6 Effect of salinity on HSP70 mRNA expression of grouper during transportation

如图6所示，4 组不同盐度处理下的运输组，石斑鱼肝脏HSP70表达量均随运输时间的延长呈先上升后下降的趋势，且随着盐度的升高，HSP70表达量逐渐降低。40‰运输组整体HSP70表达量显著高于其余3 组（P＜0.05），且最终并未恢复至初始状态，表明石斑鱼肝脏受到不可逆的机体损伤；而10、20、 30运输组石斑鱼肝脏HSP70表达量随运输时间延长逐渐下降可恢复至初始水平，说明石斑鱼在有水活运过程中肝脏受损可修复。由于石斑鱼肝脏HSP70表达量随着盐度的增大呈下降趋势，两者呈线性关系，并不适合在后续实验中作为响应面试验设计的响应值。30盐度更适于石斑鱼有水活运。

2.3 响应面试验结果及方差分析

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

根据Design-Expert 8.0软件对表3试验结果进行多元回归拟合，得到血糖、皮质醇对温度（T）和盐度（S）的二次多项回归方程分别为：

血糖=－30.129 99＋2.763 55T＋0.485 91S－0.040 000TS－0.038 628T2＋1.968 75S2

皮质醇=－261.841 42＋24.049 85T＋4.352 06S－3.625 7TS－3.277 5T2＋0.019 056S2

表4 温度和盐度对运输过程中石斑鱼血糖浓度影响的回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the effects of temperature and salinity on blood glucose level of grouper during transportation

表5 温度和盐度对运输过程中石斑鱼皮质醇含量影响的回归模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the effects of temperature and salinity on serum cortisol levelof grouper during transportation

如表4、5所示，建立的模型P值均小于0.000 1，极显著（P＜0.01），说明建立的模型有效。失拟项F值分别为6.38、5.39，表明拟合方程有效，且方程的决定系数分别为0.976 6、0.975 5，校正系数分别为0.959 9、0.958 0，说明2 个方程拟合度均极高，所选模型准确。一次项、交互相回归系数均极显著，说明温度、盐度以及交互作用对有水活运过程中石斑鱼血糖、皮质醇有极其显著的影响；二次项T2回归系数极显著，说明温度的二次效应对有水活运过程中石斑鱼血糖、皮质醇影响极其显著；二次项S2回归系数不显著，表明盐度的二次效应对有水活运过程中石斑鱼血糖、皮质醇基本无影响。

2.4 响应面分析

图7 温度和盐度对有水活运过程中石斑鱼血糖浓度（a）、皮质醇质量浓度（b）影响的响应面图Fig. 7 Response surface plots showing the effect of temperature and salinity on blood glucose concentration (a) and serum cortisol concentration (b) of grouper during transportation

如图7所示，2 个曲面较陡，说明温度和盐度对血糖浓度、皮质醇含量的交互作用明显，当盐度一定时，石斑鱼血糖浓度、皮质醇含量均随温度升高呈先升高后下降的趋势；当温度一定时，两者随着盐度的升高呈下降趋势。

2.5 优化工艺的确定和验证实验

综上可知，根据响应面软件分析筛选得出，石斑鱼有水活运工艺最优温度16.76 ℃、盐度26，在该试验条件下石斑鱼血清皮质醇质量浓度为16.44 ng/L，血糖浓度为1.83 mmol/L。根据实际可操作性，将其修正为：温度16 ℃、盐度26。在修正的优化条件下进行实验验证，平行测定3 次，得到的石斑鱼血清皮质醇质量浓度为（15.83±1.07）ng/L，血糖浓度为（1.93±0.17）mmol/L，经过t检验分析发现实际值均与预测值比较接近，说明响应面法获得的石斑鱼有水活运优化工艺是准确、可行的。

3 结 论

石斑鱼有水活运过程中，温度和盐度的变化均使石斑鱼产生应激反应从而影响其存活率、血清皮质醇质量浓度、血糖浓度以及肝脏HSP70表达量。由温度、盐度实验分别得出石斑鱼有水活运工艺温度范围为15～27 ℃、盐度范围10～ 30。通过响应面法优化石斑鱼有水活运工艺，得到石斑鱼有水活运最佳温度为16 ℃，盐度为26，在此条件下，石斑鱼血清皮质醇为（15.83±1.07）ng/L，血糖浓度为（1.93±0.17）mmol/L，为推荐的有水活运工艺。