闫鸣艳，赵晓晨，杨 萧，许 豪，安祥生，李银平*

（青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东 青岛 266042）

胶原是动物体内含量最多分布最广的一类结构蛋白，约占总蛋白量的30%[1]，广泛分布于动物的皮肤、骨骼、软骨、肌腱、角膜等部位[2]。其具有良好的生物相容性、生物可降解性、低免疫原性等功能[3]，因而在生物材料、组织工程、医药、食品和化妆品等领域具有非常广泛的应用。目前使用的胶原主要来源于猪、牛等陆生哺乳动物，近年来由于疯牛病、口蹄疫等人畜交叉流行病的频发，猪和牛中来源胶原的应用受到了限制[4]。在这种情况下，水产胶原由于原料丰富、易于提取、低抗原性、低致敏性、没有传染病危险等而受到广泛的关注[5]。罗非鱼（Oreochromis niloticus）是我国最常见的淡水鱼之一，近年来，其养殖产业发展迅速，出口量也逐年增长，由此产生大量鱼皮、鱼骨、鱼头等副产物[6]，其中鱼皮约占4.0%，而鱼皮干物质的70%以上为胶原[7]。目前罗非鱼皮胶原已被加工成多肽应用于食品、化妆品等领域，然而近年来水产胶原基生物材料领域受到广泛关注，将罗非鱼皮胶原开发成生物材料是提高水产加工附加值的另一条有效途径。

自聚集性是胶原的内在属性，利用这一属性胶原能够在体外形成类似于天然胶原纤维结构的纤维网络[8]，这也是构建胶原基生物材料及改善其性能最常用的技术手段[9]。胶原自聚集性易受外界因素的影响，如胶原浓度、溶液pH值、自聚集温度、离子强度、紫外线、电场以及外源物质等[3]。在生物体内，胶原易与多糖类成分一起构成一种有序的网络结构——细胞外基质，对于机体细胞的生长、发育和迁移具有非常重要的意义[10]，而在体外，多糖也经常与胶原一起制备复合生物材料，因此探讨多糖类物质对胶原自聚集性影响的研究较多，如Tian Huilin等[11]探讨了硫酸软骨素对体外牛皮胶原纤维的重建的影响，闫鸣艳[7]研究了海藻酸钠、硫酸软骨素、透明质酸和壳聚糖对罗非鱼皮胶原自聚集性的影响。然而，对于其他构建生物材料的氨基酸类生物大分子对胶原自聚集性影响的报道较少。

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过γ-谷氨酰键聚合而成的直链状氨基酸聚合物，表现良好的水溶性和生物降解性，并且安全无毒，在生物医学领域具有广阔的应用前景[12-13]。该物质可与其他物质复合形成新型材料，如Otani等[14]利用明胶、聚谷氨酸和碳化二亚胺制备了一种快速固化胶水，具有较好的止血效果；Shi Lu等[15]利用γ-PGA和丝胶蛋白制备了一种新型水凝胶，用作创伤敷料。本研究将着重探讨γ-PGA对罗非鱼皮酶促溶性胶原自聚集性及胶原水凝胶微观结构和性能的影响，相关研究成果能够为水产胶原基生物材料的研究和开发提供理论基础，同时对于食品营养成分的包埋缓释也具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼皮由青岛厂家提供，－20 ℃运抵实验室保存，实验时4 ℃解冻。

胃蛋白酶、I型胶原酶 美国Sigma公司；γ-PGA（分子质量为106Da） 山东福瑞达医药集团有限公司；氢氧化钠、冰乙酸、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、叔丁醇、乙醇、Tris、浓盐酸、考马斯亮蓝、十六烷基三甲基溴化铵均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

CT14RD冷冻离心机 天美（中国）科学仪器有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机 上海比朗仪器制造有限公司；722N可见分光光度计、精密PHS-3C酸度计上海佑科仪器仪表有限公司；DKB-501S电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司；S-4800扫描电镜 日本Hitachi公司；CT3质构仪 美国Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 酶促溶性胶原的制备

酶促溶性胶原（pepsin-solubilized collagen，PSC）的制备参照Huang Yuru等[16]的方法。

1.3.2 胶原自聚集动力学

参照闫鸣艳[7]的方法。称取一定量胶原于4 ℃搅拌溶解于0.5 mol/L的醋酸溶液得质量浓度为1 mg/mL的溶液，20 000×g离心后取上清液。将该上清液与40 mmol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）于冰浴中等体积混合，混合均匀后调节溶液pH 7.4，立即于28 ℃水浴中自聚集。

以40 mmol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）为溶剂配制质量浓度为1 mg/mL的γ-PGA溶液，20 000×g离心后取上清液。将该溶液与PSC溶液和磷酸缓冲液在冰浴中按照一定比例混合，使γ-PGA与PSC的质量百分比分别为20%、40%、60%、80%和100%，磷酸缓冲液和胶原的终浓度分别为20 mmol/L和0.5 mg/mL，混合均匀后调节溶液pH 7.4，于28 ℃水浴中自聚集。

每2 min采用分光光度计测定溶液在400 nm波长处的吸光度，以第0分钟时的胶原溶液为空白。依据文献[7,17]的方法对胶原自聚集动力学曲线进行分析，以ln[（Ae－At）/（Ae－A0）]对时间作图，针对不同阶段数据进行一元线性回归分析，所得斜率即为胶原自聚集速率常数。其中，At、Ae和A0为自聚集PSC溶液在时间t、平衡阶段和第0小时于400 nm波长处的吸光度。

1.3.3 自聚集比率

胶原自聚集完全后20 000×g离心30 min，收集上清液。采用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质含量；γ-PGA含量测定采用十六烷基三甲基溴化铵法[18]。自聚集比率即为上清液中某成分（PSC、γ-PGA）的降低比率，计算如式（1）所示：

1.3.4 扫描电镜观察

参照王响英等[19]的方法。胶原水凝胶于蒸馏水中浸泡脱盐24 h（每8 h更换一次蒸馏水），在2%甲醛溶液中固定12 h后依次用30%、50%、70%、80%和90%叔丁醇-乙醇溶液脱水，最后于叔丁醇中脱水3 次，每次15 min。然后将脱水凝胶置于4 ℃条件下固化，冻干后固定于样品台上，真空喷金处理，加速电压为10 kV在扫描电镜下观察样品的微观结构。

1.3.5 凝胶强度的测定

胶原（4 mg/mL）在50 mL烧杯中自聚集形成高度为45 mm的水凝胶后，采用质构仪测定其凝胶强度。采用直径为10 mm的圆柱形平头冲头（TA-10），测试速率为0.5 mm/s，压力为4.5 g，测定水凝胶被压缩4 mm时的压力。凝胶强度计算如式（2）所示：

式中：G为凝胶强度/（kN/m2）；F为压力/g；r为圆柱形平头冲头半径/mm。

1.3.6 耐酶性分析

将I型胶原酶（≥125 U/mg）溶于50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，调节pH 7.4，使酶添加量为10 U/mL。精确称取一定质量（m0）的样品于酶液中，使酶总活力与样品质量比为600 U/mg，于37 ℃放置3.5 h，取出后立即在冰浴中终止反应，用蒸馏水脱盐后干燥称量其质量（m1）。降解率计算如式（3）所示：

1.3.7 热稳定性分析

胶原水凝胶热稳定性的测定参照Yunoki等[20]的方法。将在10 mL试管中高度为（40±3）mm的水凝胶放置于温度为30 ℃的水浴中，保持30 min，观察水凝胶的变化，然后以1 ℃为间隔依次升温至50 ℃，并在每个温度条件下保温30 min，当观察到水凝胶开始融化时记录温度，此时温度即为水凝胶的热变性温度。

1.4 数据处理

数据统计采用Origin 7.5进行ANOVA单因素方差分析。P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 γ-PGA对罗非鱼皮PSC自聚集动力学的影响

图1 γ-PGA对罗非鱼皮PSC自聚集动力学曲线（a）及线性拟合关系（b）的影响Fig. 1 Effect of γ-PGA on the kinetic curve (a) and linear fi tting relationship (b) of PSC self-assembly from tilapia skin

表1 γ-PGA对罗非鱼皮PSC自聚集速率常数的影响Table 1 Effect of γ-PGA on the rate constant of PSC self-assembly from tilapia skin

在不同含量γ-PGA存在的条件下，罗非鱼皮PSC的自聚集动力学曲线均为S型（图1a），表明胶原仍然表现较好的自聚集能力，但是当γ-PGA/PSC达到60%及以上时，胶原自聚集动力学曲线线性增长阶段斜率逐渐降低，说明胶原自聚集速率减缓，原因主要是γ-PGA的等电点偏酸性，而胶原自聚集pH 7.4，在此条件下γ-PGA带大量的负电荷，其结合到PSC上后使得胶原所带负电荷增加、分子间静电斥力增大[21]。依据文献[7,17]的自聚集动力学理论对胶原自聚集动力学曲线进行分析（图1b和表1），结果表明在γ-PGA存在的条件下，胶原的自聚集过程仍然包含两个阶段[11]：第1阶段（成核阶段），胶原分子结构发生变化形成晶核，但吸光度并未显著增加；第2阶段（生长阶段），在晶核的基础上胶原分子进一步生长直至形成胶原纤维甚至纤维束，进而形成宏观三维网络结构[22]，表现为吸光度显著增加直至稳定。然而，在γ-PGA存在的条件下，胶原的自聚集动力学参数发生了变化。通过对所得数据进行分析，对于纯胶原来说，第1和第2自聚集阶段的分界点在10 min时，随着γ-PGA含量的增加，分界点依次为12、12、16、18 min和18 min；采用一元线性回归方法对每一阶段的数据进行拟合，发现随着γ-PGA含量的增加，胶原的成核时间逐渐延长，第1阶段的速率常数显著降低，主要与γ-PGA带大量的负电荷有关；而第2阶段的速率常数呈现先增加后降低的趋势，原因可能是γ-PGA有大量的侧链羧基，有利于增加胶原间的结合位点，因而纤维生长的速率常数是增加的，但是随着其含量的增加，负电荷带来的斥力是主要影响因素，因而速率常数降低。由表1还可以看出，第1阶段的速率常数远低于第2阶段，因此成核阶段是影响胶原自聚集性的速控阶段。图2为γ-PGA对胶原自聚集比率的影响，可以看出当γ-PGA/PSC不高于80%时，随着其含量的增加，胶原自聚集比率没有显著变化，然而当γ-PGA/PSC进一步增加到100%时，其值显著降低；而对于γ-PGA来说，其自聚集比率是随着含量的增加而显著增加的，可能与γ-PGA含有大量侧链羧基有关。

图2 γ-PGA对罗非鱼皮PSC自聚集比率的影响Fig. 2 Effect of γ-PGA on the reconstruction rate of PSC self-assembly from tilapia skin

2.2 γ-PGA对罗非鱼皮PSC水凝胶微观结构的影响

罗非鱼皮PSC自聚集后能够形成外观为白色的水凝胶，γ-PGA对水凝胶微观结构的影响如图3所示，可以看出在不同含量的γ-PGA存在的条件下，水凝胶均呈现三维纤维网络结构，与猪皮[10]、牛皮[11]、罗非鱼鳞[23]、江鼠大鳍鳠鱼皮[24]、草鱼皮和鳞[25]等胶原水凝胶结构类似。但是在三维网络结构中，胶原纤维间的致密度不同。当γ-PGA/PSC增加到80%时，胶原纤维致密度呈现增加趋势，然而当其进一步增加到100%时，纤维间的致密度下降，原因可能是在γ-PGA含量比较低的时候，其与PSC相互作用导致交联位点增加，但是随着γ-PGA的增多，大量的分子与PSC相互作用从而屏蔽了胶原分子本身的交联位点。

图3 γ-PGA对罗非鱼皮PSC水凝胶微观结构的影响Fig. 3 Effect of γ-PGA on the microstructure of PSC gel from tilapia skin

2.3 γ-PGA对罗非鱼皮PSC水凝胶性能的影响

图4 γ-PGA对罗非鱼皮PSC水凝胶的凝胶强度和耐酶性的影响Fig. 4 Effect of γ-PGA on the gel strength and enzymatic resistance of PSC hydrogels from tilapia skin

胶原自聚集水凝胶结构类似于天然细胞外基质，但是纯胶原水凝胶在凝胶强度、热稳定性、耐酶性等方面均存在不足，限制了其在生物材料等领域的应用[26]。因此本实验探讨γ-PGA对罗非鱼皮PSC水凝胶性能的影响，结果如图4所示。当γ-PGA/PSC增加到80%时，胶原水凝胶的凝胶强度呈现增强趋势，但是当其进一步增加到100%时，其凝胶强度显著下降，这主要与凝胶的三维网络结构有关，如前所述，当γ-PGA/PSC增加到80%时，胶原纤维致密度呈现增加趋势，然而当其进一步增加到100%时，纤维间的致密度下降。同时发现γ-PGA对胶原水凝胶的耐酶性非常不利，随着其含量的增加，水凝胶的酶降解率显著增加。前人研究表明I型胶原酶首先降解胶原螺旋区的775位甘氨酸残基和776位亮氨酸残基形成的肽键[27-28]，由此推测γ-PGA的引入导致了胶原纤维中氨基酸残基的位置发生了改变，Gly-Leu被暴露出来导致更容易被胶原酶所降解；降解率显著增加还可能与三维网络结构中胶原纤维间作用力较弱有关。此外，实验中对γ-PGA对罗非鱼皮PSC水凝胶热稳定性的影响进行了探讨，结果表明随着γ-PGA含量的增加，胶原水凝胶热稳定性并未发生显著变化，均在（47±1）℃开始融化，可能是胶原纤维间作用力较弱导致的。综上所述，γ-PGA对罗非鱼皮PSC水凝胶的耐酶性和热稳定性并未显示积极的影响，因此参照其他文献[29-30]，在下一步研究中将引入交联等技术改善复合水凝胶的性能。

3 结 论

γ-PGA对罗非鱼皮PSC自聚集动力学具有显著影响，能够延缓胶原晶核的形成，但是在γ-PGA/PSC不大于80%时可加快胶原纤维的生长。自聚集后，胶原能够形成外观为白色的水凝胶，其微观结构为三维纤维网络，γ-PGA能够影响到纤维的致密度，在γ-PGA/PSC增加到80%时，网络致密度表现增加趋势，相对应的凝胶强度也表现类似趋势。然而，γ-PGA对胶原水凝胶的耐酶性和热稳定性并未表现积极的影响，因此下一步研究将引入交联等技术进一步改善水凝胶的性能。