丁世彬，高丽云，李玉春，卜勇军，张国富

(1. 新乡医学院，河南新乡 453003； 2. 河南省分子诊断与检验医学协同创新中心，新乡 453003)

大气细颗粒物2.5(particulate matter 2.5, PM2.5)是指空气动力学直径小于2.5 μm的大气颗粒物，是目前我国空气污染物的主要组成(雾霾)。由于PM2.5粒径较小，它可以随着呼吸过程到达呼吸道细支气管和肺泡腔并沉积[1]，因此PM2.5对人体健康的危害程度远大于其他粒径较大的颗粒物。流行病学和临床研究证实，大气颗粒物(particulate matter，PM)污染水平升高与呼吸疾病的入院率及死亡率密切相关[2-4]。动物实验显示：急性和亚慢性PM2.5暴露均能导致肺炎症[5-6]；但慢性PM2.5暴露对动物肺炎症的影响尚无报道。机体的先天免疫系统包含多种受体，称为模式识别受体(PRRs)，PRRs能检测即将发生的危险(如环境污染物或内源性有毒物质)，并引发保护性反应[7]。目前，NLRP3炎性小体是PRRs中研究较多的一种。越来越多的证据显示，NLRP3炎性小体与许多呼吸系统疾病(如慢性阻塞性肺疾病，呼吸系统炎症)的发生关系密切[8-9]，并且PM2.5能激活肺组织NLRP3炎性小体[6]，但NLRP3炎性小体在PM2.5导致肺损伤的机制尚不十分清楚。本研究旨在明确慢性PM2.5暴露对肺炎症和NLRP3炎性小体活性的影响，为PM2.5暴露所致肺毒性及其可能分子机制提供动物实验证据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体重23～25 g，来自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京) 2015-0012】。小鼠饲养在室温21～25℃和湿度60%～70%的环境中，自由摄食普通饲料和饮水。全部动物实验操作均严格遵守新乡医学院实验动物伦理管理条例，并经过新乡医学院实验动物伦理委员会许可【XXMU-2016-0007】。

1.1.2 试剂与仪器

白细胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18 ELISA试剂盒(eBioscience，美国)，Caspase-1活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，中国)，引物合成(上海生工生物技术有限公司，中国)，RNA提取试剂盒和SYBR试剂盒(大连宝生物工程有限公司，中国)，兔单克隆F4/80抗体(Cell Signaling Technology，美国)；石英纤维滤膜(PALL，美国)，低温离心机(Eppendorf，德国，5424R)，血细胞检测仪(Rayto，美国)，荧光定量PCR仪(罗氏，Light Cycler 480，瑞士)，全自动酶标仪(Thermo，美国，Enspire)。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5样品采集及处理

2016年10月至2017年3月间，在新乡医学院7楼楼顶使用大流量PM2.5采样器(Tisch Environmental，美国，TE-6070C)收集PM2.5，用石英纤维滤膜(20.3×24.5 cm)作为收集介质。每日连续收集24 h后更换滤膜，并于-20℃保存。将载有PM2.5的滤膜剪碎，于超纯水中超声20 min，真空干燥后称重，用生理盐水配成2.25 mg/mL和7.15 mg/mL的PM2.5悬液待用。

1.2.2 动物分组及PM2.5染毒

选取6周龄雄性C57BL/6J小鼠，小鼠饲养于SPF级动物房【SYXK(豫)2014-0005】，适应性喂养一周后将小鼠随机分为三组(每组10只)：对照组给予生理盐水，低剂量PM2.5组[2 mg/(kg·bw)]和高剂量PM2.5组[10 mg/(kg·bw)]。小鼠采用气管滴注的方式染毒，每3 d染毒一次，连续染毒20次。气管滴注方法如下：小鼠经乙醚麻醉后，用镊子将小鼠舌头拉出暴露口腔和气管，用气管滴注套管将50 μL液体滴入气管。

1.2.3 动物血液和肺组织提取及指标检测

小鼠染毒结束后，用戊巴比妥(20 mg/kg)麻醉，心脏取血后，脱臼处死，血细胞检测仪进行血细胞计数。迅速分离肺组织，称取100 mg肺组织，按1∶9比例加入生理盐水进行匀浆。将匀浆液6000 r/min离心后取上清液，按照IL-1β和 IL-18的ELISA检测试剂盒说明书测定肺组织匀浆中IL-1β和IL-18的水平；用试剂盒测定肺组织中caspase-1的活性。

1.2.4 肺组织免疫荧光染色

小鼠处死后，迅速分离右肺组织固定于4%多聚甲醛溶液，经酒精梯度脱水、石蜡包埋后进行F4/80抗体的免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察肺组织F4/80水平。

1.2.5 肺组织RNA提取及NLRP3炎性小体相关基因检测

向50 mg肺组织中加入0.8 mL TRIzol，并用玻璃匀浆器匀浆后按说明书提取肺组织总RNA。NLRP3炎性小体相关基因的引物设计：NLRP3基因的引物序列为F5′-TGGGTTCTGGTCAGACACGAG-3′， R5′-GGCGGGTAATCTTCCAAATGC-3′; 衔接分子凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的引物序列为F5′-GGAGTCGTATGGCTTGGAGC-3′，R5′-CGTCCACTT CTGTGACCCTG-3′; Caspase-1的引物序列为F5′-TGCCGTGGAGAGAAACAAGG-3′，R5′-CCCCTGACA GGATGTCTCCA-3′; GAPDH基因的引物序列为F5′-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，R5′-TGCCTG CTTCACCACCTTCT-3′。按照RNA逆转录试剂盒说明书，将1 μg总RNA加入20 μL反应体系逆转录成cDNA；并依据荧光实时定量PCR试剂盒说明书，将25 μL反应体系(10 ng cDNA，0.5 μmol引物和SYBR Green PCR混合试剂)下完成目的基因的扩增和检测。将GAPDH基因作为内参基因。目的基因的表达用2-△△CT法进行计算。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 PM2.5暴露对小鼠血细胞的影响

由表1可见，低剂量PM2.5组和高剂量PM2.5组小鼠的血中性粒细胞百分比明显高于对照组，差异有统计学意义(P< 0.01)；并且两组小鼠的血单核细胞百分比明显低于对照组，差异有统计学意义(P< 0.01)。但三组小鼠的血白细胞总数和淋巴细胞百分比无明显差异(P> 0.05)。

2.2 PM2.5暴露对小鼠肺组织巨噬细胞表达的影响

由图1的肺组织F4/80免疫荧光染色可见，与对照组小鼠相比，低剂量PM2.5组和高剂量PM2.5组小鼠肺组织F4/80表达明显增多，这些结果表明低剂量PM2.5暴露和高剂量PM2.5暴露能明显增加小鼠肺组织的巨噬细胞浸润。

表1 慢性PM2.5染毒对小鼠血细胞的影响Table 1 Effect of PM2.5 exposure on blood cells in the s，n =8)

注：与对照组比较，*P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.01.

图1 三组小鼠肺组织F4/80表达情况(免疫荧光染色，×400)Figure 1 Expression of F4/80 in the mouse lung tissues of three groups(Immunofluorescence staining，×400)

2.3 PM2.5暴露对小鼠肺组织IL-1β和IL-18表达水平及caspase-1活性的影响

由图2可见，与对照组相比较，低剂量PM2.5组和高剂量PM2.5组小鼠的肺组织IL-1β和IL-18表达水平及caspase-1活性均明显增加，差异有统计学意义(P< 0.01)；然而，低剂量PM2.5组和高剂量PM2.5组小鼠的肺组织IL-1β和IL-18表达水平及caspase-1活性差异无统计学意义(P> 0.05)。

2.4 PM2.5暴露对小鼠肺组织NLRP3炎性小体相关基因表达的影响

由图3可见，与对照组相比较，低剂量PM2.5组和高剂量PM2.5组小鼠的肺组织NLRP3和ASC的mRNA表达水平均明显增加，差异有统计学意义(P< 0.01)。但三组小鼠的肺组织caspase-1的mRNA表达差异无统计学意义(P> 0.05)。

注：A. IL-1β水平；B. IL-18水平；C. Caspase-1活性；与对照组比较，*P<0.01。图2 PM2.5暴露对小鼠肺组织IL-1β和IL-18表达水平及caspase-1活性的影响Note. A. IL-1β. B. IL-18. C. Caspase-1 activity. Compared with the control group,*P<0.01.Figure 2 Effects of PM2.5 exposure on IL-1β, IL-18 expression and caspase-1 activity in the mouse lung tissues

注：A. 肺NLRP3 mRNA水平；B. 肺ASC mRNA水平；C. 肺Caspase-1 mRNA水平；与对照组比较，*P<0.01。图3 PM2.5暴露对小鼠肺组织NLRP3炎性小体相关基因 mRNA表达的影响Note. A. NLRP3 mRNA. B. ASC mRNA. C. Caspase-1 mRNA. Compared with the control group，*P<0.01.Figure 3 Effects of PM2.5 exposure on the mRNA expression of NLRP3 inflammasome-related genes in the mouse lung tissues

3 讨论

近年来，由于工业生产，化石燃料的燃烧及汽车尾气的排放等造成我国中北部平原，长江三角洲和珠江三角洲地区经常频繁遭受空气污染(尤其是雾霾)的困扰[10]。PM2.5是雾霾的主要组成，由于其粒径较小，并且能在空气中悬浮较长时间，因此PM2.5暴露对肺等靶器官的影响受到越来越多研究者的关注。之前的研究已经证明，炎症在PM暴露导致的人和动物的肺部疾病发生、发展的全过程都发挥至关重要作用[11-12]。许多动物实验研究都关注急性PM2.5暴露对肺的影响，并发现急性PM2.5暴露能导致动物的肺损伤发生[13-15]。本实验主要研究慢性低剂量PM2.5暴露对肺炎症和NLRP3炎性小体活性的影响，并分析慢性PM2.5暴露造成肺损伤的可能机制。

本实验根据小鼠的生理参数和世界卫生组织(WHO)的第一个过渡阶段标准(24 h平均PM2.5浓度为75 μg/m3)将10 mg/(kg·bw)的PM2.5暴露剂量作为高剂量[16]，将2 mg/(kg·bw)的PM2.5剂量作为低剂量开展暴露研究。肺泡巨噬细胞是肺组织的第一道免疫屏障，其可对进入肺内的细菌、多种颗粒物(例如PM2.5)等异物进行吞噬。本实验我们通过对小鼠肺组织F4/80免疫荧光染色发现，慢性PM2.5暴露能导致肺组织巨噬细胞增多，这表明慢性PM2.5暴露导致小鼠肺组织发生了广泛的炎症。NLRP3炎性小体是先天免疫系统中的细胞内多蛋白细胞质复合物组成的NOD样受体，它由NLRP3蛋白、衔接分子凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和丝氨酸蛋白酶caspase-1组成[17-18]。NLRP3炎性体控制IL-18的分泌及IL-1β的成熟和分泌[18-19]；而促炎细胞因子IL-1β募集巨噬细胞，中性粒细胞和肥大细胞以引发炎症反应[20]。据报道，PM2.5可激活人单核细胞白血病细胞(THP-1)中的NLRP3并诱导BALB/c小鼠的肺纤维化[6]。此外，急性5 mg/(kg·bw)剂量的PM2.5暴露能增加NLRP3表达，并导致了肺炎症；而0.5 mg/(kg·bw)和2.0 mg/(kg·bw)两个剂量的PM2.5急性暴露未能影响NLRP3表达，不会导致肺炎症[21]。我们还发现：两个剂量的PM2.5慢性暴露均能显著增加肺组织NLRP3和ASC的mRNA表达和caspase-1的活性，这表明慢性低剂量PM2.5暴露也能激活肺组织NLRP3炎性小体。研究报道，PM2.5[5、10、15 mg/(kg·bw)]暴露3 d能导致大鼠肺巨噬细胞caspase-1表达增加[21]，但本研究中只观察到caspase-1的活性增加，没有观察到肺组织中caspase-1表达增加，这表明慢性低剂量PM2.5可能通过调节caspase-1活性参与NLRP3炎性小体的活性上调。促炎细胞因子IL-1β是肺中炎性细胞因子IL-1家族的重要成员，它是介导炎症的关键因子；IL-18可与IL-12协同作用，通过激活T细胞和NK细胞诱导干扰素-γ的产生[7]。Wang等[22]的研究发现，PM2.5急性暴露能导致BALB/c小鼠急性肺炎症，增加肺泡灌洗液和肺组织IL-1β表达水平。与之前的研究一致，我们观察到慢性低剂量PM2.5暴露能增加肺组织的IL-1β和IL-18的蛋白表达水平。以上结果表明：PM2.5可能激活肺组织NLRP3炎性小体，并增加IL-1β和IL-18分泌；即使低剂量的PM2.5长期暴露也会造成肺组织的炎症损伤。据报道，急性PM2.5暴露能升高中性粒细胞百分比，降低单核细胞百分比和淋巴细胞百分比[23]。与之前的结果一致，本研究发现：慢性PM2.5[2，10 mg/(kg·bw)]暴露能导致白细胞分类中中性粒细胞百分比升高，单核细胞百分比降低。以上研究结果表明：慢性PM2.5暴露有可能导致系统炎症发生。

综上所述，慢性PM2.5暴露可能通过激活肺组织NLRP3炎性小体进而导致肺组织炎症发生，这提示抑制NLRP3炎性小体的活性及其调控可能成为防治PM2.5所致呼吸系统疾病的新靶点。