王钰婷 王玉柱 刘锦燕 孟玲宁 李卫华 项明洁,

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025；2.复旦大学生殖与发育研究院上海市计划生育科学研究所，国家卫生健康委员会计划生育药具重点实验室，上海 200032；3.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科，上海 200020)

外阴阴道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是由念珠菌引起的女性生殖道感染，其病原菌以白念珠菌为主，主要表现有外阴瘙痒、灼痛，严重时坐卧不安、尿急、尿频等。流行病学资料显示，约有70%～75%的女性一生中至少感染过1次VVC，作为女性生殖道感染最常见的原因之一，VVC在世界范围内十分常见，影响女性健康[4]。

白念珠菌能够在酵母相和菌丝相之间转换，这种表型转换的能力对其致病性和毒力有着重要影响。在VVC发生过程，阴道上皮细胞是白念珠菌侵袭的主要靶细胞，同时，阴道上皮细胞可以通过释放各种细胞因子从而调动体液免疫和细胞免疫来防御白念珠菌感染。本研究通过热灭活白念珠菌和活的白念珠菌感染阴道上皮细胞，检测细胞因子的表达水平，从而比较酵母相白念珠和菌丝相白念珠菌感染阴道上皮细胞免疫反应的差异。

1 材料与方法

1.1 研究对象

菌株与细胞株 菌株为白念珠菌SC5314(ATCC MYA-2876)，由本实验室保存；细胞株为阴道上皮细胞株VK2/E6E7(ATCC CRL-2616)由美国哈佛大学Fichorova 博士惠赠。

试剂及耗材 K-SFM无血清培养基(含0.05g/L BPE牛垂体提取物、0.1g/L rEGF重组人上皮细胞因子、0.4 mmol/L CaCl2)购自Gibco公司。按配方(2%葡萄糖+2%蛋白胨+1%酵母提取物)配制液体酵母浸出粉胨葡萄糖 (yeast extract peptone dextrose，YPD ) 培养基、YPD 固体培养基。ELISA检测试剂盒购自R&D Systems公司。RNA抽提试剂TrizolTMReagent购自Invitrogen。逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real time)和qPCR检测试剂盒TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNase H Plus)购自Takara。引物由上海生工合成，序列见表1。IL-8的序列来自https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/，TNF-α和GAPDH的序列合成来自参考文献。

1.2 研究方法

白念珠菌的制备 将复苏的白念珠菌SC5314分区划线于YPD培养基中，37℃培养过夜，挑取单克隆菌落至3 mLYPD培养液中，并在30℃ 200 r/min的恒温震荡仪中孵育16 h。随后用PBS调整菌液至109/mL，将菌置于100℃热处理1 h可得到灭活的酵母相白念珠菌，在YPD培养基中37℃孵育48 h未生长，即为灭活成功[11]。感染阴道上皮细胞之前，用K-SFM培养基重悬菌液。

阴道上皮细胞株传代培养[12]37℃孵育5 min复苏冻存细胞株；将复苏的细胞接种至含K-SFM的培养瓶中，置5% CO2、37℃培养箱中培养。待融合率达到80%～90%进行细胞传代，将细胞转移至6孔板中继续培养，细胞量可达2×105/孔。细胞贴壁后，对细胞进行免疫刺激。

表1 引物序列

白念珠菌对阴道上皮细胞行免疫刺激 实验前吸弃6孔板中的培养液，将待测阴道上皮细胞分为7个实验组，第1组：加入1 mL K-SFM培养基作为空白对照；第2～4组：每孔加入800 μL K-SFM培养基，200L白念珠菌活菌菌液，使菌液终浓度分别为2×105/mL(MOI=10)，1×106/mL(MOI=50)，2×107/mL(MOI=100)；第5～7组：每孔分别加入200 μL MOI=10、50、100的白念珠菌灭活菌液，其余操作同活菌菌液。MOI(multiplicity of infection)：感染指数，此处即白念珠菌与VK2/E6E7细胞之比

ELISA和RT-qPCR检测TNF-α和IL-8 白念珠菌刺激上皮细胞3 h、6 h、12 h后，收集培养液，1000 g×20 min，提取上清液。按ELISA试剂盒说明书操作，试验中标准品和样本检测时作双复孔，检测TNF-α和IL-8的分泌水平。同时采用Trizol法抽提上皮细胞RNA，逆转录后行实时荧光检测，反应条件为：95℃ 30 s(1X)；95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s(40X)，采用赛默飞StepOnePlus PCR仪检测荧光信号，使用2-ΔΔt法处理数据。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism7软件进行数据分析处理，采用t检验(Student’sttest)进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 观察白念珠菌感染阴道上皮细胞

对照组中的阴道上皮细胞在K-SFM培养基中贴壁良好，细胞形态完整，多呈卵圆形或梭形、多角形铺路石状，胞浆均匀，轮廓清晰光滑(见图1)。热灭活白念珠菌和活的白念珠菌在K-SFM培养基中呈现出不同的形态：热灭活白念珠菌在K-SFM培养基为酵母相，呈球形或椭球形；而活的白念珠菌则呈菌丝相，镜下可见细长的菌丝。此外，当两种不同形态的白念珠菌感染阴道上皮细胞时，酵母相白念珠菌聚集于阴道上皮细胞四周，而菌丝相白念珠菌的菌丝连接成网状结构，覆于阴道上皮细胞之上。

当阴道上皮细胞受到白念珠菌的感染后，细胞形态随着感染时间发生明显的变化。感染3 h后，细胞变圆，贴壁不佳，部分细胞胞内出现空泡。当MOI较大时，细胞出现了膜裂解、胞核肿胀破裂、细胞形态不完整的情况，部分细胞破裂死亡。

2.2 酵母相和菌丝相白念珠菌诱发阴道上皮细胞的免疫反应

通过检测阴道上皮细胞VK2/E6E7分泌的IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表达水平，发现酵母相和菌丝相白念珠菌均能在一定条件下诱导阴道上皮细胞产生免疫反应。

阴道上皮细胞受到白念珠菌刺激后，IL-8和TNF-α的mRNA显著上升(见表2)。在酵母相感染组中，IL-8和TNF-α mRNA的最大上升幅度在刺激3 h后出现，且随着MOI值的增大，细胞因子mRNA的最大上升幅度变小。甚至在MOI=100时，所检测细胞因子mRNA的最大上升幅度延迟至6 h出现，且与对照相比，差异无统计学意义(其中IL-8组P=0.330，TNF-α组P=0.273)。其次，在菌丝相感染组中，IL-8和TNF-α mRNA的变化趋势与酵母相白念珠菌感染后的变化一致， 即随着MOI值的增大，最大上升幅度变小，且峰值延迟出现。

此外，白念珠菌刺激阴道上皮细胞后，细胞分泌到培养基上清中的IL-8和TNF-α蛋白水平上升(见表3)。空白对照中未检测到IL-8和TNF-α的表达，但感染组细胞上清中均能在一定时间点检测到IL-8和TNF-α。在酵母相感染组中，IL-8早于TNF-α被检测到，且随着MOI值的增大，IL-8的水平也随之升高，最大上升幅度出现得更早。然而，菌丝相白念珠菌感染后的细胞分泌IL-8的水平与酵母相相反，即随MOI值的增大，IL-8的水平随之下降，且最大上升幅度出现得更晚。

2.3 酵母相和菌丝相白念珠菌诱发阴道上皮细胞免疫反应的强度不同

尽管酵母相和菌丝相白念珠菌均可刺激阴道上皮细胞产生炎症因子，但是两者所诱发的IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表达水平有较大的差异(见图2)。

如图2所示，无论是何种浓度的感染比例，菌丝相感染组细胞产生的IL-8 mRNA水平均高于酵母相感染组。同样，除了在MOI=10，3 h的条件下，其余条件下，酵母相感染组产生的TNF-α mRNA水平均高于酵母相感染组。

此外，如图3所示，对于IL-8蛋白表达组，当MOI=10时，菌丝相感染组的IL-8蛋白质水平高于酵母相感染组。然而随着MOI的增大，情况出现翻转。其次，由于检测出TNF-α蛋白的时间点较少，无法比较同一时间点上两相白念珠菌刺激细胞产生TNF-α蛋白的水平，但是根据表3的结果显示，菌丝相感染组可以更早地产生TNF-α(3 h或6 h)，而酵母相感染组则相对较迟地产生TNF-α(12 h)。

图1白念珠菌对VK2/E6E7细胞形态的影响。采用不同的MOI(10，50，100)的白念珠菌感染VK2/E6E7细胞3h后，100X镜下观察。Control：空白对照组，A、C、E：酵母相白念珠感染VK2/E6E7细胞，B、D、F：菌丝相白念珠菌感染VK2/E6E7细胞

Fig.1The effect ofCandidaalbicanson morphology of VK2/E6E7.Candidaalbicansof different MOI(10，50，100)infect VK2/E6E7 cell lines under magnifications 100X. Control：Blank Control Group，A、C、E：YeastCandidaalbicansinfect VK2/E6E7 cells，B、D、F：HyphalCandidaalbicansinfect VK2/E6E7 cells

表2 酵母相和菌丝相白念珠菌刺激阴道上皮细胞 VK2/E6E7 细胞因子和趋化因子mRNA分泌情况

注：“a”示P<0.05，数据为与K-SFM培养基对照组相比，对照组的表达量均一化为1。

表3 酵母相和菌丝相白念珠菌刺激阴道上皮细胞 VK2/E6E7 细胞因子和趋化因子蛋白质的分泌情况

注：“a”示P<0.05，“-”示未检测出。数据为与未感染组K-SFM培养基对照组相比,单位：pg/mL.

图2酵母相和菌丝相白念珠菌刺激后，阴道上皮细胞 VK2/E6E7分泌IL-8和TNF-α mRNA水平的比较。采用不同的MOI(10、50、100)的白念珠菌感染VK2/E6E7细胞。A-C：MOI=10，50，100感染组IL-8 mRNA水平。D-F：MOI=10，50，100感染组TNF-α mRNA水平

***：P<0.001，**：P<0.01， *：P<0.05

Fig.2IL-8 and TNF-α mRNA secretion in VK2/E6E7 cells inoculated with yeastCandidaalbicanscompared with hyphalCandidaalbicans.Candidaalbicanswith different MOI(10，50，100)infecting VK2/E6E7 cells. A-C：IL-8 mRNA expression of infection group with MOI=10，50，100. D-F：TNF-α mRNA expression of infection group with MOI=10，50，100. ***：P<0.001，**：P<0.01， *：P<0.05

图3酵母相和菌丝相白念珠菌刺激后，阴道上皮细胞 VK2/E6E7分泌IL-8蛋白水平的比较。采用不同的MOI(10，50，100)的白念珠菌感染VK2/E6E7细胞。A-C：MOI=10，50，100感染组IL-8 蛋白水平。***：P<0.001，**：P<0.01， *：P<0.05

Fig.3IL-8 protein secretion in VK2/E6E7 cells inoculated with yeastCandidaalbicanscompared with hyphalCandidaalbicans.Candidaalbicanswith different MOI(10，50，100)infecting VK2/E6E7 cells. A-C：IL-8 protein expression of infection group with MOI=10，50，100

***：P<0.001，**：P<0.01， *：P<0.05

3 讨 论

白念珠菌是常见的条件致病菌，其可通过调控形态以适应宿主体内的环境变化，酵母-菌丝相转换及菌丝生长都与白念珠菌的致病力密切相关。目前关于白念珠菌引起疾病的研究多集中于系统性白念珠菌病，在系统性感染中，菌丝的形成可刺激机体产生更强的免疫反应，同时对于系统性感染小鼠模型的致死率往往也更高。而在由白念珠菌引起的外阴阴道炎中，现有的研究多局限于感染菌株耐药性和机制的研究，宿主上皮细胞对白念珠菌刺激的免疫应答研究有限。

本研究通过构建阴道上皮细胞体外模型，采用菌丝相和酵母相白念珠菌进行免疫刺激，对阴道上皮细胞的免疫应答进行了观察。我们的研究显示，菌丝相白念珠菌引起阴道上皮细胞的免疫应答早于酵母相白念珠菌，强度也高于后者。除了在MOI=10，3 h的条件下，酵母相白念珠菌刺激细胞产生的TNF-α mRNA水平高于菌丝相，其余条件下炎症因子IL-8和TNF-α mRNA均为菌丝相感染组高于酵母相感染组。MOI=10时，菌丝相感染组的IL-8蛋白质水平均高于酵母相感染组。同时，菌丝相感染组检测到TNF-α蛋白水平的时间点(3 h或6 h)早于酵母相感染组(12 h)。说明在MOI=10时，菌丝相白念对阴道上皮细胞细胞产生的炎症反应更强。但是，随着MOI的增大，情况出现翻转。这种情况可能是由于菌丝相侵袭力高于酵母相导致的，使得白念珠菌对于细胞的毒性作用大于激发炎症。比如，Gao等使用不同MOI的活白念珠菌感染阴道上皮细胞，结果显示随着MOI的增大，胞内释放乳酸脱氢酶(LDH)水平增加，提示细胞毒性显著提高，且细胞分泌IL-8蛋白质水平随之降低。此外，在口腔黏膜感染中，易于形成菌丝的白念珠菌刺激细胞分泌的炎症因子高于菌丝缺陷株。本研究前期也曾用MOI=0.1，MOI=1感染过阴道上皮细胞，但是在较短时间内(3 h)未能检测到IL-8和TNF-α蛋白的分泌。我们因此认为，研究白念珠菌刺激阴道上皮细胞的免疫机制，MOI=10的白念珠菌是较适宜的条件。

不同时相白念珠菌感染阴道上皮细胞后产生炎症因子的差异可能是由于其免疫机制不同。白念珠菌与宿主细胞相互作用的关键是其被宿主细胞识别。既往的研究发现在人体正常阴道组织中可表达TLR2和TLR4模式识别受体，而TLR2和TLR4可识别白念珠菌细胞壁外层中的甘露糖蛋白。此外，经热灭活处理后的白念珠菌能使其细胞壁最内层-葡聚糖暴露，从而被C型凝集素受体Dectin-1识别，激起细胞的免疫反应。然而目前，菌丝相和酵母相白念珠菌在阴道上皮细胞识别方面的机制为见深入报道。

白念珠菌被识别后如何激活细胞内相关通路的研究已屡见报道。白念珠菌的感染可激活以A431细胞系形成的阴道上皮层模型内的MAPK通路，随着菌丝形成增多，MAPK通路中的MKP1和c-Fos的活化逐渐增强，菌丝逐渐浸润上皮层。此外，白念珠菌可激活阴道上皮细胞的NF-ΚB信号通路，且VVC患者的阴道灌洗液中亦可查见NF-ΚB下游分子(TNF-α、IL-8、IL-6等)显著增加[22]。

本研究证实了菌丝相和酵母相白念珠菌均能诱发阴道上皮细胞出现显著免疫反应。在白念珠菌MOI=10的感染条件下，菌丝相白念引起的免疫反应强于酵母相白念。此外，不同时相的白念引起细胞免疫强度的差异提示了两相白念珠菌引起免疫应答的机制可能不同。