朱光俊 张钦怡 苏正仙 金先富 张慧斐 毕晓洁

遗传性凝血因子XI（FXI）缺陷症为罕见的常染色体隐性遗传病，于1953年首次被Rosenthal等[1]报道，目前，突变类型已超过 200 多种（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=F11），国外统计其发病率为 1/500000～1/1000000，且存在种族差异[2]。目前我国对于遗传性FXI缺陷症的报道较少，具体的致病机制也不是很明确。笔者对1例遗传性FXI缺陷症进行表型和基因型研究，研究其分子致病机制，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 该家系共5人，包括先证者及父亲、儿子、妻子，家系谱见图1。先证者，男，32岁。因“反复牙龈出血”于2018年3月5日来我院检查。实验室常规凝血功能检查发现：活化部分凝血活酶时间（APTT）显著延长，FXI活性（FXI:C）极低，D-二聚体轻度增高，其余指标均在正常参考范围内。先证者肝肾功能正常，未使用抗凝药物。先证者父亲偶有痔疮出血，父母非近亲结婚，其他家系成员均无自发出血或血栓形成病史。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 仪器：STA-R MAX全自动血凝仪（法国STAGO公司）、全自动生化分析仪AU5830（美国雅培公司）、PCR扩增仪ABI Thermal cycler 2720（美国ABI公司）、核酸蛋白分析仪（美国Beckman公司）、电泳仪（美国Bio-rad公司）、凝胶成像系统（上海天能公司）。试剂：凝血项目检测试剂盒（法国STAGO公司）、DNA提取试剂盒、抗原检测试剂盒、PCR扩增试剂盒（上海西塘生物科技技术公司）。

图1 遗传性凝血性因子XI缺陷血症家系图

1.2.2 引物 引物序列参考文献[3] ，由华大基因生物公司合成。

1.2.3 标本采集和处理 采集所有受试者外周血2.7ml，用 0.109mol/L 枸橼酸钠 1∶9 抗凝，3 000 r/min 离心10 min。上层乏血小板血浆用于凝血项目检测；下层血细胞用于提取DNA（血样），提取完成后放置于-20℃冰箱保存待用。

1.2.4 凝血项目检测 在全自动血凝分析仪上采用一期凝固法检测PT、APTT、FIB、TT、凝血因子Ⅱ活性（FⅡ：C）、凝血因子 V 活性（FV：C）、凝血因子Ⅶ活性（FⅦ：C）、凝血因子Ⅷ活性（FⅧ：C）、凝血因子Ⅸ活性（FⅪ：C）、凝血因子 X 活性（FX：C）、FXI活性（FⅪ：C）及凝血因子Ⅻ活性（FⅫ：C）；免疫比浊法检测纤维蛋白（原）降解产物（FDP）、D-二聚体；采用ELISA法检测FⅪ抗原（FⅪ：Ag）含量。

1.2.5 基因测序 使用DNA提取试剂盒提取所有成员外周血基因组DNA，经PCR扩增后外送上海华大基因检测公司进行测序，测序结果采用Chromas软件与美国NCBI基因库（GenBank）所公布的基因序列进行比对，发现突变后进行反向测序予以证实。

1.2.6生物学信息软件分析采用Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org）、PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2）和 SIFT（http://sift.jcvi.org）3 个在线生物信息软件，通过评分预测突变位点对蛋白质功能的影响。

2 结果

2.1 先证者以及家系成员凝血功能检测结果 见表1。

表1 先证者及家系成员凝血指标检测结果

2.2 基因分析结果 先证者F11的11号外显子存在L442Cfs*8杂合突变。先证者父亲在该位点的测序结果与先证者一致，除此以外所有其它的基因测序结果都显示为正常。见图2、3。

图2 先证者及父亲F11基因11号外显子L442Cfs*8突变

图3 F11基因11号外显子野生基因型

2.3 生物学信息软件分析结果 PolyPhen-2评分结果为1.00分，预示突变为有害突变；Mutation Taster评分结果为disease causing，预示此突变可引起疾病；SIFT评分结果为0.10分，预示此突变引起蛋白质功能改变。

3 讨论

FXI是一种丝氨酸蛋白酶原，在血浆中它主要与高分子量激肽原（HWMK）结合形成复合物[4]。编码FXI的基因F11位于4q35，共含有15个外显子和14个内含子，全长23kb[5]，l号外显子编码的是5′端非转录区，2号外显子编码前导肽链，3-15号外显子共编码607个氨基酸分子，形成的FXI包括含有4个Apple结构域的重链以及一个胰蛋白酶杨丝氨酸蛋白酶催化区（SP）的轻链。成熟的FXI分子含有两个相同单体，由两个残基Cys321形成二硫键组成[6]。

FXI在内源性凝血途径发挥重要作用，通过一系列的凝血因子逐级活化过程，最终激活纤维蛋白原，形成纤维蛋白网，使血小板形成的团块更加牢固[4,7]。遗传性FXI缺陷症临床表现多样，突变基因杂合子为正常的30%～70%，而纯合子的血浆FXI水平仅为正常的0～20%[8]，该病患者无性别差异，且一般无自发性出血[9]，因此疾病的诊断和治疗都存在多变性。推测原因是FXI参与凝血过程的放大阶段而不是影响凝血的起始阶段，并且活化的血小板颗粒含有FXI，总活性得到一定的补偿，因此FXI缺陷的患者多数是在手术、创伤后才会表现出止凝血障碍[10]。出血的严重程度常与累及的组织部位有关，原因是FXI可促进凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）的产生，从而可以稳定已经形成的凝血块在纤溶活性高的部位更容易出血，常见于口腔黏膜[11]。

本文中先证者APTT为92.9s，查FXI活性2%，凝血因子抗原3.6%，活性与抗原成等比例下降，呈交叉反应物质阴性特点。基因测序结果显示，先证者F11的11号外显子存在L442Cfs*8杂合突变，其父亲同样携带该突变基因，可以诊断为遗传性FXI缺陷症。根据Mutation Taster分析显示，L442Cfs*8属于移码突变，突变位点编码的亮氨酸（Leu）变成半胱氨酸（Cys），并且其相对应的mRNA在突变位点之后的第8个密码子变成终止密码，使得编码氨基酸翻译提前终止，形成截断蛋白，分子链变短，结构完整性受到影响，因此突变后FXI抗原和活性均下降。另外两个生物信息学软件均指出L442Cfs*8杂合突变会导致蛋白质的功能发生改变，与疾病有关。同时，L442位于轻链的丝氨酸蛋白酶催化区，Leu突变成Cys后蛋白的结构发生改变，FXI酶原活化的过程同时受到抑制。本文中先证者与其父亲携带相同的突变基因，但先证者FXI活性和抗原均明显降低，且出现反复自发性牙龈出血，而其父亲却仅有偶发痔疮出血，推测其原因是，先证者8号外显子同时存在c.935A＞C多态性，导致K312T突变，根据Mutation Taster分析，8号外显子编码FXI的A3结构域，是FXI的重要结合部位[12]，该多态性会造成蛋白质的功能发生改变，具体机制还有待进一步研究。

综上所述，该遗传性凝血因子XI缺陷症家系先证者及其父亲F11基因11号外显子均携带有L442Cfs*8杂合突变，此突变是导致患者FXI：C明显下降的主要原因。但具体作用机制尚有待于更进一步体外表达实验加以证实。